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CD69在小鼠嗜酸性粒细胞中的表达及其抗体对哮喘小鼠气道炎症的抑制作用及机制研究

汪慧英  
【摘要】: 研究背景 嗜酸性粒细胞(Eos)是哮喘发病机制中最重要的炎症效应细胞。Eos在气道的浸润与活化与哮喘的严重程度及气道高反应性(AHR)的进展相关,IL-5缺陷鼠进一步证实了气道Eos的浸润与粘液分泌、AHR的内在联系。哮喘气道慢性炎症本质为气道Eos的激活与凋亡障碍。诱导气道活化Eos凋亡是治疗哮喘的关键。目前哮喘的急性发作仍需应用全身激素。它可非特异性地作用于所有细胞并抑制皮质轴反应导致全身副作用,这给它的应用带来限制,特别是儿童和青少年哮喘患者的治疗;此外,还有少部分病人是激素抵抗型的。因此,寻找特异性诱导气道活化Eos凋亡的药物仍是全球研究工作者的艰巨任务。 细胞表面抗原CD69的发现为这一需求带来了新的希望。CD69于1981年发现,早期被称为AIM、EA-1、LEU-23、MLR-3等,被认为是T细胞的活化标记物,在T细胞活化后1小时即有表达,并可持续至72小时,对T细胞的增殖分化有一定的作用。后来的研究发现CD69可在几乎所有髓系细胞中表达。CD69通常以同源二聚体形式存在,由分子量为225KD的两条多肽链通过不同的糖基化组成。CD69在细胞表面表达均为磷酸化形式,这对它与其它细胞表面的蛋白分子连接很重要。CD69在细胞的生物功能中起着重要的信号传导作用。它可介导细胞的激活及激活后细胞因子的合成。更重要的是,CD69对细胞的凋亡中也有重要作用。体内激活的具有CD69高表达的T细胞体外易于快速自发凋亡,CD69~(-/-)小鼠腹腔和脾中淋巴细胞存活率增高,凋亡明显减少,脾淋巴细胞在激活后的凋亡明显低于野生型小鼠,并有凋亡信号Caspase-3的活化减少。 关于CD69的研究主要为它在T细胞和NK细胞中的表达,对它在Eos表面的表达研究较少,且均为人Eos体外实验的研究。这些研究显示,人外周血Eos在各种不同的细胞刺激因子作用下激活可表达CD69,哮喘患者气道中Eos也可表达CD69。但小鼠Eos活化后是否表达这种分子尚未有研究。 本课题分为两部分,第一部分是测定小鼠活化Eos表面CD69的表达。利用IL-5高分泌转基因小鼠,观察体外不同的细胞刺激因子作用下小鼠Eos表面CD69的表达及哮喘小鼠体内外周血、气道Eos中CD69的表达。第二部分则为观察抗CD69单克隆抗体(antiCD69mAb)对哮喘小鼠抗原激发后气道AHR与炎症的作用,并与哮喘小鼠在激发前后应用地塞米松(DXM)的作用相比较,为哮喘急性发作的治疗提供新的思路。 研究目的 利用IL-5高分泌转基因小鼠外周血中有大量Eos的特点,提纯其外周血Eos,观察在细胞刺激因子PMA+MA的作用下Eos表面CD69表达的动态变化,以及不同的细胞因子对此表达的影响;以确立CD69是否可以作为小鼠Eos活化的表面标记分子。同时,利用成熟的哮喘小鼠模型,观察antiCD69mAb对抗原致敏激发诱导的小鼠气道反应性和炎症的作用,与DXM的作用相比较,通过BALF中细胞因子水平测定探讨两者对炎症抑制的作用机制。 研究方法 1.采集IL-5高分泌转基因小鼠外周血,利用磁珠分离系统阴性选择提纯外周血中Eos。以PMA+MA刺激提纯的Eos,检测在1h,12h,18h,24h不同时刻Eos表面CD69的表达及细胞的存活率,设空白培养液培养的Eos为对照组。检测不同的细胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ、GM-CSF、IL-12、IL-13培养18小时后Eos表面CD69的表达及细胞的存活率。同时观察哮喘小鼠外周血和BALF中Eos表面CD69的表达。 2.利用成熟哮喘小鼠模型,在OVA激发后腹腔注射antiCD69mAb观察它对哮喘的气道高反应性和气道炎症的抑制作用,并与OVA激发前、后腹腔注射DXM对哮喘的抑制作用相比较,检测小鼠BALF中IL-5、GM-CSF、CRP的水平来探讨两者对哮喘气道病理生理变化的影响机制。 研究结果 1.CD69在Eos中的表达 1.1 PMA+MA激活后Eos表面CD69表达与细胞存活率的动态变化 新鲜提纯的Eos表面并无CD69的表达。但在PMA+MA激活后1h Eos表面即有CD69的表达,12h时表达到达高峰,至少持续24小时(p<0.05)。空白培养液培养的Eos也有同样的变化(p<0.05)。不同时刻点PMA+MA激活的Eos表面CD69表达显著高于空白培养液中的Eos(p<0.05)。体外Eos可有自发的细胞凋亡,但PMA+MA激活后Eos的凋亡至明显加速。 1.2不同细胞因子作用下Eos表面CD69的表达与细胞的存活率 不同细胞因子培养的Eos均有CD69的表达,但只有IFN-γ及GM-CSF、IL-13组显著高于对照组(P<0.05)。IL-5、GM-CSF可明显提高Eos存活率(p<0.001),IL-4、IL-12、IFN-γ对Eos表面CD69的表达与Eos的存活率无明显作用。 1.3哮喘小鼠外周血、BALF中Eos表面CD69的表达 哮喘组小鼠BALF中Eos表面有CD69的表达,但外周血中Eos表面无CD69的表达。 2.antiCD69mAb对哮喘小鼠气道高反应性和气道炎症的作用 2.1气道反应性测定 哮喘模型小鼠对吸入Mch的气道反应性显著高于正常小鼠,抗原激发前应用DXM和抗原激发后应用antiCD69mAb对哮喘小鼠的气道高反应性可完全抑制。而抗原激发后应用DXM仅部分抑制哮喘小鼠的气道高反应性。 2.2 BALF中Eos计数 抗原致敏激发可诱导小鼠BALF中Eos大量积聚,而正常小鼠BALF中Eos几乎为零。抗原激发前应用DXM和抗原激发后应用antiCD69mAb可完全抑制BALF中Eos的积聚,抗原激发后应用DXM具有同样的作用。 2.3肺组织中Eos计数及粘液分泌测定 正常小鼠气道内几乎无Eos的积聚和粘液的分泌。而抗原的致敏激发可诱导大量Eos积聚在气道组织和粘液的大量分泌。抗原激发前应用DXM和抗原激发后应用antiCD69mAb均可完全抑制气道中Eos的积聚和粘液的分泌,抗原激发后应用DXM则部分抑制此病理变化。 2.4 BALF中的GM-CSF及IL-5、CRP的测定 正常小鼠BALF中IL-5无法测出,但GM-CSF、CRP存在一定的基线水平。哮喘小鼠BALF中IL-5水平有明显增高,GM-CSF、CRP水平无改变。抗原激发前应用DXM和抗原激发后应用antiCD69mAb可抑制降低IL-5水平的增高,抗原激发后应用DXM对此无影响。 结论 1.CD69可作为小鼠Eos的表面活化标记物。它在静息Eos表面不表达,而在活化Eos表面有高度表达。 2.CD69在Eos表面的表达与细胞的凋亡密切相关。 3.antiCD69mAb可诱导哮喘小鼠气道Eos凋亡,对已形成的气道病理生理有抑制作用。 4.抗原激发前应用DXM可有效抑制气道的炎症,但抗原激发后使用DXM仅能部分抑制气道的炎症。


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