芳樟醇通过激活GADD45α/JNK信号通路选择性诱导淋巴细胞白血病细胞凋亡的研究

【摘要】： 白血病是一种常见的严重危害人类健康的造血系统恶性肿瘤，其确切病因与发病机制迄今仍未阐明。而目前临床常用治疗手段都存在一定的局限性，现阶段化疗仍然是大多数白血病患者最常用的治疗手段。通过化疗能使大部分初发白血病患者在短期内获得完全缓解，但是很多患者最终因化疗药物的严重毒副作用被迫中断治疗或因肿瘤细胞对化疗药物产生耐药而导致复发。因此，寻找新的高效低毒抗白血病药物仍然是当今白血病研究领域中重要课题之一。 我们在筛选抗肿瘤小分子化合物时，发现天然小分子化合物芳樟醇(Linalool)能明显抑制多种人淋巴细胞白血病细胞增殖，而对正常人骨髓造血细胞及外周血细胞的增殖没有明显的影响，为此我们用MTT技术、流式细胞术、肿瘤相关信号通路分析技术以及Western blot、RT-PCR等手段和方法探讨了芳樟醇对不同类型白血病细胞系及相应正常造血细胞中的影响情况，及其诱导白血病细胞凋亡的可能分子机制。 实验材料和方法 1．细胞培养： (1)人白血病细胞培养：人T淋巴细胞白血病细胞系H9，Molt-4和Jurkat；人B淋巴细胞白血病细胞系Raji；人单核细胞白血病细胞系THP1和U937；人慢性髓系白血病细胞系K562；人粒细胞系白血病KG-1： (2)正常人造血细胞培养：正常人骨髓单个核细胞和外周血单个核细胞来自健康志愿者。 2．细胞增殖抑制试验：采用MTT法。 3．细胞周期分析：流式细胞术 4．细胞凋亡检测与分析：流式细胞术，PI／Annexin-V标记物检测 5．肿瘤相关信号通路分析：采用GEArray Q系列的Human Cancer Pathway FinderⅡGene Array分析白血病细胞经芳樟醇药物处理后基因表达谱的变化情况。 6．RT-PER分析：分析和检测白血病细胞经芳樟醇处理后RNA表达的变化。 7．Western blot分析：分析和检测白血病细胞经芳樟醇处理后蛋白表达的变化。 结果 1．芳樟醇能明显抑制人T细胞白血病细胞系Molt-4、H9、Jurkat和B细胞白血病细胞系Raji生长，其48小时IC_(50)值分别为7.09μM、5.79μM、11.3μM和6.46μM。芳樟醇对人髓系白血病细胞系THP1、U937、和KG-1细胞生长仅有轻度或者没有抑制作用，其48小时IC_(50)值分别为34.89μM、203.99μM和371.69μM。芳樟醇对人骨髓造血细胞和外周血细胞生长没有明显影响，当药物终浓度为100μM时，正常人骨髓造血细胞和外周血细胞生长良好，未见有明显生长增殖抑制。 2．芳樟醇能够明显诱导人T细胞白血病细胞系Molt-4凋亡，其凋亡细胞比例明显上升。 3．芳樟醇处理Molt-4细胞后，能使其G_0／G_1、S期、G_2／M期细胞比例均有明显下降，而处于凋亡期细胞比例则明显增加。 4．芳樟醇处理Molt-4细胞后，能使肿瘤相关信号通路芯片基因表达谱发生变化，12小时时到达高峰，主要表现为与DNA损伤信号通路相关的一些基因表达上调，P53、P21、P27、P57、GADD45α的表达都有明显上调。 5．芳樟醇处理Molt-4细胞后，RT-PCR和Western Blot的实验结果与芯片分析结果基本一致，主要表现为GADD45α上游调控的P53等的上调以及下游c-jun和JNK的激活和上调，从而启动细胞凋亡的过程。 结论 1．芳樟醇通过诱导细胞凋亡的方式从而选择性抑制人淋巴细胞白血病细胞的生长和增殖，可能是一种新型的抗白血病化疗药物。 2．芳樟醇是通过GADD45α／c-jun／JNK激酶途径，启动JNK凋亡信号传导通路来启动细胞凋亡过程。 3．芳樟醇能够杀伤处于静止期的白血病细胞，提示其可能对白血病干细胞具有杀伤作用，值得进一步研究。