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金葡菌肠毒素A基因及其突变体表达产物生物学活性研究

范芳华  
【摘要】: 背景和目的葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxins A,SEA)是金黄色葡萄球菌产生的肠毒素之一,为SEA基因编码的257个氨基酸组成的多肽。SEA是一种细菌超抗原,在极低剂量时即可直接与抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)MHCⅡ类分子和T细胞抗原识别受体(T cell receptor,TCR)Vβ片段高亲和力地结合,诱导T淋巴母细胞有丝分裂并促进T细胞释放IL-1β、IL-2和TNF-γ等多种细胞因子,从而发挥抗肿瘤作用。因此,SEA具有被开发成升白细胞、抗肿瘤类药物的前景。然而,SEA具有肠毒性,可引起呕吐、腹泻,并导致小鼠死亡。众所周知,多肽或蛋白类毒素的毒性主要取决于分子中的活性基团,利用定位突变技术改变SEA分子中毒性相关活性基团的氨基酸组成,极有可能获得低或无毒性、保持促淋巴细胞增殖和抗肿瘤活性的SEA突变体。 本研究中,我们扩增并克隆了不含信号肽序列的全长SEA基因,根据SEA分子中肠毒性相关位点Protein Data Bank预测结果并参考文献,采用引物突变法构建了多个目的定位突变体及其原核表达系统,并根据突变前后目的重组蛋白细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抗肿瘤细胞活性变化对突变体进行了筛选,以期为进一步研发安全有效SEA突变体药物奠定基础。 实验方法采用高保真PCR和T-A克隆法,从金黄色葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增并克隆了不含信号肽序列的SEA基因。采用突变引物PCR构建SEA基因定位突变体。建立SEA基因及其定位突变体原核表达系统。Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白,SDS-PAGE鉴定,并对纯化的重组蛋白进行透析复性和滤过除菌。采用TCID_(50)法测定目的重组蛋白对Vero细胞的细胞毒性。采用MTT比色法分别检测不同浓度的目的重组蛋白促小鼠脾细胞增殖及对抑制KB及HL-60癌细胞株生长的作用。 结果所克隆的SEA基因核苷酸序列与报道序列的相似性为100%,7种突变体均在既定位置获得预期的密码子突变。rSEA和各突变体重组蛋白表达量约为细菌总蛋白的52%。rSEA对Vero细胞TCID_(50)为4.1μg,其突变体重组蛋白分别为5.8~23.5μg。1和5μg/ml的rSEA及其5种突变体重组蛋白rSEA/H187A、rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H187A/D227A和rSEA/H225A/D227A对小鼠脾细胞均有明显的促增殖作用(P<0.05),10和20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白促小鼠脾细胞增殖活性与100μg/ml PHA相似(P>0.05)。5~20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白作用的小鼠脾细胞上清及其上清与脾细胞混合物均能有效地抑制KB和HL-60细胞生长(P>0.05)。 结论本研究成功地构建了SEA基因突变体及其高效原核表达系统,其表达产物的细胞毒性均有所降低。由于rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H225A/D227A细胞毒性较低、促脾细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长活性较强,可作为研制升白细胞、抗肿瘤SEA相关药物的候选突变体。


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