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猕猴桃脂氧合酶基因家族的功能解析及其调控

张波  
【摘要】: 以美味猕猴桃(Actinidia deliciosa)果实为试材,开展了LOX基因家族成员克隆,并对其进行生物信息学分析,建立了基于LOX基因家族成员表达的QPCR技术体系,研究各成员在不同器官、果实生长发育和成熟衰老进程中的表达模式,以及不同处理(温度和乙烯)对LOX基因的表达调控,鉴别了猕猴桃果实后熟软化和香气形成相关家族成员。主要结果如下: 1、利用猕猴桃EST库及相关生物信息学手段,克隆了LOX基因家族成员6个,命名为AdLox1、AdLox2、AdLox3、AdLox4、AdLox5和AtLox6,编码区长度分别为2739、2595、2739、2709、1359和1557bp,其中,AdLox1、AdLox2、AdLox3和AdLox4为全长cDNA序列。猕猴桃LOX基因家族成员的序列同源性存在差异,AdLox2和AdLox5氨基酸序列同源性最高,约74%,而AdLox3和AdLox5仅为49%。生物信息学分析表明,AdLox1、AdLox3、AdLox4和AdLox6可能具有13-LOX活性,而AdLox2和AdLox5则属于9-LOX类型,它们均具有保守的38个氨基酸残基,但13-LOX在N端含有额外约60个氨基酸残基。猕猴桃AdLox1与番茄TomLoxD具有最高氨基酸序列同源性(80%),AdLox2和AdLox5与TomLoxA高度聚类,序列同源性分别为68和75%,AdLox4和AdLox6与TomLoxC的氨基酸序列同源性分别为62和63%,AdLox3与其它植物LOX序列同源性低于55%。 2、完善并建立了基于LOX基因家族成员功能研究的QPCR技术体系,该体系具有良好稳定性和重复性,针对基因家族成员序列差异设计的特异性引物,有效地避免了交叉扩增污染,提高了基因表达检测的准确性。 3、猕猴桃AdLox1在根、茎和花中表达水平接近;AdLox2转录本主要在根、茎和叶中积累,且水平相近;AdLox3、AdLox4和AdLox6表达分布类似,主要存在于茎和叶;AdLox5在根中具有较高表达水平,但绝对转录本很低。果实生长发育进程中,AdLox1、AdLox2、AdLox3和AdLox6具有相似的表达模式,其转录本水平从20至80daa呈下降趋势,在100daa则略微增强,然后再次下降直至果实采收;AdLox4的表达水平在果实发育进程中则维持基本稳定,但转录本水平较高;AdLox5表达水平很低。 4、20℃下猕猴桃果实成熟衰老进程中,AdLox1和AdLox5表达随乙烯积累呈增加趋势,而AdLox2、AdLox3、AdLox4和AdLox6转录本在果实后熟软化过程中趋于下降。外源乙烯处理(100μl/L,20℃,24h)显著加速果实后熟软化进程,诱导LOX活性上升和MDA含量增加,促进了AdLox1和AdLox5表达水平增强,而AdLox2,AdLox3,AdLox4和AdLox6的转录本则被明显抑制,在处理24h内分别下降了5、20、10和2倍。烟草叶片的瞬时表达结果表明,AdLox1显著加快叶绿素降解(P<0.05),促进叶绿素荧光下降(P<0.05),诱导组织衰老,而AdLox2则与野生型对照植株无显著差异。 5、0℃低温处理168h,猕猴桃果实硬度和TSS维持稳定水平,转入20℃货架期贮藏后,成熟进程显著加快。0℃贮藏过程AdLox1、AdLox5和AdLox6表达水平逐渐增强并72h左右达到高峰,随后下降,这一趋势与LOX活性变化相吻合。AdLox2、AdLox3和AdLox4转录本水平在低温贮藏期间维持稳定。 6、LOX活性在猕猴桃果实成熟进程中呈峰型变化(约180h出现高峰),伴随有己醛和(E)-2-己烯醛含量减少。至20℃贮藏276h,果实(E)-2-己烯醛水平比180h时下降了约7倍。LOX基因家族AdLox2、AdLox3、AdLox4和AdLox6的表达趋势与猕猴桃果实香气物质变化相一致。果实圆片组织的离体试验表明,1.0mmol/L LA和1.0mmol/L LeA处理显著促进LOX活性(P<0.05),诱导AdLox4和AdLox6表达增强,其中AdLox6的转录本分别增加了12和6倍,而AdLox2和AdLox3表达水平基本不变。 上述研究结果表明,LOX基因家族在猕猴桃果实生长发育和成熟衰老进程中具有表达差异,对温度和乙烯处理表现出不同的应答模式。


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