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Bt水稻及其外源基因表达蛋白的环境行为与生物学效应

汪海燕  
【摘要】: 国内外在转Bt基因作物的培育上,已经取得了较大进展。我国在转Bt基因水稻的转育方面居世界先进水平,且很有可能成为世界上率先商品化种植转基因水稻的国家之一。因此,有关Bt水稻的环境安全性研究显得尤为迫切和重要。Bt水稻中外源基因及其表达产物可能是一类潜在的环境外源污染物,有关这类生物大分子在农业生态系统中的环境行为等方面的研究已成为国内外新的研究热点,具有重要的科学和现实意义。然而,由于Bt作物中表达的Bt蛋白丰度较低,要从中获得足够量的Bt纯蛋白有一定的难度,致使目前研究多采用植物组织或源于微生物表达的Bt蛋白,难以全面反映Bt作物表达的Bt蛋白的实际环境行为。此外,外源基因的插入打乱了原有的基因网络,可能引起转基因作物的生理生化过程或代谢途径的改变从而产生多效性,转基因作物对逆境(重金属胁迫)的应答能力是否会因此而改变,国内外迄今报道甚少。克螟稻(Ke-Ming-Dao,KMD)是含有Bt基因(cry1Ab)和选择标记基因(hpt与nptⅡ)且高抗8种鳞翅目害虫的转Bt基因水稻。有关克螟稻及其外源基因表达蛋白(Cry1Ab、HPT和NPTⅡ蛋白)的环境行为与生物学效应的研究迄今鲜见报道。 本研究以克螟稻及其亲本(秀水11)为试材,在建立Cry1Ab蛋白纯化制备方法、土壤中Cry1Ab蛋白的提取方法以及HPT蛋白酶联免疫分析方法的基础上,通过实验室和田间试验,研究了(1)KMD中Cry1Ab蛋白的时空表达、根系分泌及根际残留;(2)Cry1Ab纯蛋白在膨润土、高岭石、腐殖酸及土壤中的吸附行为;(3)Cry1Ab蛋白在土壤中的好气和淹水降解动态;(4)KMD中HPT和NPTⅡ蛋白的时空表达、根系分泌及根际残留特性;(5)重金属胁迫条件下KMD对多种元素的吸收和积累。主要结果如下: 1.Cry1Ab蛋白纯化制备和土壤中该蛋白提取方法的建立 采用O.1mol·L~(-1)Na_2CO_3-NaHCO_3+5mmol·L~(-1)DTT缓冲液作为提取剂,从Bt水稻秸秆中提取Cry1Ab蛋白。提取液经过冷冻干燥浓缩、截留分子量浓缩至较小体积,然后用(NH_4)_2SO_4分级沉淀(20%去杂蛋白,80%收集Cry1Ab蛋白)、离子交换色谱(A-50)、凝胶渗透色谱(G-150)等步骤后,得到了纯度较高的Cry1Ab蛋白(经SDS-PAGE电泳检测相对纯度80%以上)。生物活性测定表明,所得的Cry1Ab纯蛋白保留杀虫活性。 从土壤中高效提取蛋白具有较高的难度。国内外现有的方法提取某些土壤中的Cry1Ab蛋白效率普遍较低(提取效率4.6~35%)。为了研究该蛋白在土壤环境中的行为与归趋,建立适宜的提取方法是尤为重要的。本研究通过Cry1Ab蛋白和Bt水稻秸秆添加试验,以0.1mol·L~(-1) Na_2CO_3-NaHCO_3(pH10.0)+5.0mmol·L~(-1) EDTA+50mmol·L~(-1) Na_4P_2O_7·10H_2O+0.1%Triton X-100为提取缓冲液,并结合Cry1Ab-ELISA方法,从不同土壤中高效提取Cry1Ab蛋白的效率分别46.18~81.73%和47.72~82.25%。 2.HPT蛋白检测ELISA方法的建立 利用一种简便并且高效的微生物表达体系,将hpt基因的全编码序列克隆到原核表达质粒pGEX-KG上,在E.Coli菌株BL21(DE3)-pLys中进行诱导表达,获得了融合蛋白GST-HPT,经Thrombin凝血酶酶切过夜,再经过柱纯化后获得不含GST且具有生物活性的HPT纯蛋白,所得蛋白纯度>90%。MALDI-TOF-MS分析表明,HPT蛋白分子量为39.4kD。用HPT纯蛋白免疫家兔,制备了高效价的多克隆抗体,进而构建了双抗夹心酶联免疫检测方法,其灵敏度为0.31ng·mL~(-1)。利用该方法可以检测转基因植物组织中微量的HPT蛋白。 3.克螟稻Cry1Ab蛋白的表达、分泌与根际土中的残留特性 分蘖始期至成熟期,KMD地上部和根中Cry1Ab蛋白的表达量分别为3.23~8.22μg·g~(-1)FW和0.68~0.89μg·g~(-1)FW;KMD根系分泌的Cry1Ab蛋白量仅为1.66~48.02ng/簇·天;KMD根际土中的Cry1Ab蛋白残留量低于检测限(0.5ng·g~(-1)air-dried soil),这表明田间种植条件下生育期间中的Cry1Ab蛋白不易转移到根际土壤中。考虑到KMD地上部相对较高的蛋白表达量(μg级),因此应该尽量避免KMD秸秆还田。 4.Cry1Ab纯蛋白在腐殖酸、膨润土、高岭石及不同土壤中的吸附解吸规律 Cry1Ab蛋白与腐殖酸、膨润土和高岭石的吸附解吸动态。高岭石、膨润土和腐殖酸对Cry1Ab蛋白的吸附量分别为131.27~1731.44ng·g~(-1)、107.09~1846.42ng·g~(-1)和78.02~1066.10ng·g~(-1),它们相应的吸附率分别为41.34~79.95%、26.60~69.90%和30.34~45.83%。这3种吸附剂对Cry1Ab蛋白的吸附量随添加浓度的增加而增加,而吸附率却随蛋白添加浓度呈相反变化趋势。对Cry1Ab蛋白的吸附能力大小依次为高岭石>膨润土>腐殖酸,而解吸附能力大小为腐殖酸>高岭石>膨润土。 Cry1Ab蛋白与不同土壤的吸附解吸动态。Cry1Ab纯蛋白在供试的5种土壤中的吸附率随添加浓度的增加而下降。浓度为782.55ng·mL~(-1)和125.64ng·mL~(-1)的Cry1Ab蛋白时小粉土的吸附率均为最高,分别是24.85%和40.81%;而黄松土和滨海盐土的吸附率相对最低,分别是9.12%,31.67%和12.47%,30.75%。解吸附率随着吸附量的减少而降低。小粉土的解吸附率比较低,分别是12.95%和5.88%。土壤对Cry1Ab纯蛋白的单位吸附量与Cry1Ab蛋白加入浓度和土壤OM呈现显著的正相关。 5.Cry1Ab纯蛋白和KMD秸秆在土壤及水体中的降解规律 Cry1Ab纯蛋白在水溶液和土壤中的降解。Cry1Ab纯蛋白在溶液(pH 4.0~8.0)中的水解与溶液pH成负相关,与蛋白浓度成正相关。好气条件下,Cry1Ab纯蛋白的添加培养试验表明,在5种不同土壤中其降解趋势符合一级动力学反应方程C=C_0exp(-kt),半减期为19.6~41.3d,主要是生物降解,与土壤的单一因子无显著相关性。相比之下,Cry1Ab蛋白在淹水土壤中的降解速度较慢,半减期要长得多,为45.9~141d。这就表明厌氧条件下,转基因作物表达的Cry1Ab蛋白相对稳定。 KMD秸秆在土壤中的降解动态。在好气培养的90d内KMD秸秆在土壤中的降解动态显著符合以下方程C=C_0exp(-kt)。他们的可提态Cry1Ab蛋白的半减期的变化从11.5~34.3d。蛋白降解最快的土壤是碱性土。相反地,蛋白降解速率较慢的土壤是酸性土,他们是半减期为34.3d的黄金泥和23.9d的红砂土。进一步的试验表明,黄松土中添加不同比例的KMD秸秆后Cry1Ab蛋白的降解也符合一级动力学方程。分别添加3%、4%和7%KMD秸秆时,蛋白降解半减期分别是9.9d、13.8和18d。由此可知,随着秸秆添加量的增加,Cry1Ab蛋白在土壤中的半减期有相应的延长。在淹水条件下培养60d的秸秆中Cry1Ab蛋白降解也显著符合动力学方程。秸秆中的Cry1Ab蛋白在酸性土壤,黄金泥和红砂土中降解较慢,其半减期分别为70.0d和61.3d。而在中性或碱性土中降解速度较快,半减期为43.9d。 6.KMD中HPT蛋白和/或NPTⅡ蛋白的表达、根系分泌动态及根际土残留特性 不同生育期的KMD地上部与根部的HPT蛋白含量分别约为24.59~60.12ng·g~(-1)FW和15.67~33.13ng·g~(-1)FW,相应的NPTⅡ蛋白含量分别为1.61~2.99ng·g~(-1)FW和3.86~9.97ng·g~(-1)FW。其精米中HPT蛋白含量约为5.28ng·g~(-1)DW,而NPTⅡ蛋白未检出。这意味着它们不会导致致敏性,可能不会直接对人体健康造成危害。同时,KMD表达的NPTⅡ蛋白和HPT蛋白不易通过根系分泌途径向土壤环境转移,而且其根际土中也未检出NPTⅡ蛋白。因此,田间种植的KMD不会导致HPT蛋白和/或NPTⅡ蛋白的严重积累,这也就预示着HPT蛋白和/或NPTⅡ蛋白不会直接对农业生态环境构成威胁。 7.重金属污染区KMD中元素吸收和积累的变化初探 本论文研究了在Cd、Cu、Pb和Zn胁迫条件下,KMD和亲本对Al、As、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、K、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Zn15种元素的吸收和积累。发现在四种污染条件下,KMD和亲本对这15种元素的吸收和积累规律既存在相似性也存在明显的差异。尤其在Cd浓度为5、10和20mg·kg~(-1)soil的污染条件下,KMD糙米中Cd含量分别达到0.68±0.12、0.68±0.04和1.45±0.09mg·kg~(-1),均已超过了国际限量标准的范围,这表明在高Cd污染地区种植KMD可能存在着安全隐患。Cu污染条件下,KMD秸秆中有毒金属元素Cr和Cd的含量都有不同程度的提高。同时,还发现在Cd污染条件下,KMD地上部对Cd元素有较明显的积累效应;Pb污染条件下,KMD地上部中Pb元素的含量也有了显著的提高。从有毒重金属Cd或Pb积累的角度看,在Cd或Pb污染地区种植KMD时应该尽量避免其秸秆还田。 由于本研究是在盆栽试验和单一土壤研究中发现的上述现象,仍需要田间、多点和多年种植条件下的试验结果加以验证,因此,本文建议:在转Bt基因水稻商业化生产前,应该进一步拓展现有的生态风险性和安全性评价内容,加强对重金属胁迫条件下转Bt基因作物有关元素的吸收和积累规律以及其它非预期效应的研究。


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