收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

蝶蛹金小蜂卵黄发生与卵子发生的生理与分子基础

董胜张  
【摘要】: 本论文选择了菜粉蝶Pieris rapae蛹期的优势内寄生蜂——蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum作为研究对象,在制备该蜂Vt单克隆抗体和解析Vg cDNA序列的基础上,分别从生理生化、细胞和分子水平对其卵黄发生、卵子发生和生殖调控的机制进行了系统的研究。主要结果概括如下: 1.Vt的纯化与生化特性 非变性PAGE电泳结果表明,在雌蜂的血淋巴中和成熟卵内存在一条雌性特异蛋白条带,而在雄蜂的血淋巴中未发现相对应的条带,该蛋白条带能被脂蛋白、糖蛋白和磷酸化蛋白特异性染色。因此推测此雌性特异条带为该蜂的Vt,而雌蜂血淋巴中对应的为Vg,其天然分子量约为370 kDa。SDS-PAGE分析表明,Vg/Vt是由分子量分别约为205和165kDa的两个亚基组成。通过P-100凝胶过滤层析和Q-1阴离子交换层析的方法,从卵内可溶性蛋白中纯化出Vt。双向电泳分析表明,成熟卵内可溶性蛋白约由118个点组成,等电点主要集中于5~8.5之间,分子量主要集中于130~250 kDa和25~50 kDa两个范围,Vt约占到总蛋白的50~70%,Vt两个亚基的等电点均约为8.2。 2.Vt单克隆抗体的制备与应用方法的建立 采用杂交瘤细胞技术,分别制备得4株能稳定分泌抗蝶蛹金小蜂Vt的单克隆抗体(mAb),即PpVt mAb1、PpVt mAb2、PpVt mAb3和PpVt mAb4。4株单抗分别制取了腹水,其腹水上清的效价均达到10~5以上,且对PpVt mAb1的腹水进行了纯化。4株单抗免疫球蛋白的重链和轻链的亚类均为IgG1和κ类型。 不同组织的Western免疫印迹结果表明,mAb不仅特异性识别卵巢内Vt,而且识别雌蜂血淋巴中Vg,但与雄蜂血淋巴无反应,可以用于Vg/Vt的定性或定量检测。通过对直接ELISA、间接ELISA、异种双抗夹心ELISA和异源双抗夹心ELISA方法的比较,确定了微量检测蝶蛹金小蜂体内Vg/Vt的最适ELISA方法,即异源双夹心ELISA法。该方法可用于单头雌蜂体内Vg/Vt的定量检测,其检测灵敏度约为20 ng/mL。 3.卵巢发育与卵黄发生 蝶蛹金小蜂的卵巢由3对卵巢管组成。在羽化后的48 h内,该蜂的卵巢管由透明、细丝状变为充满成熟卵的饱满状。该蜂血淋巴中Vg的出现始于隐成虫期,其含量在羽化后24 h内快速增加,从刚羽化时的170 ng/female增加到24 h的580 ng/female,随后便开始减少,但是,48 h后又开始增加。雌蜂羽化时,卵母细胞即开始摄取Vg,卵巢内Vt开始沉积。羽化后48 h内其含量快速增长,且在48 h,达到最高,约为4.51μg/female,而后则开始减少,到72 h,仅有3.9μg/female。此外,卵巢内Vt的含量与卵巢发育进度存在显著的相关性。 4.卵子发生及其细胞凋亡 根据卵子的形态变化可将蝶蛹金小蜂的卵子发生分为5个时期,即卵室(egg chamber)形成期(S1)、滋养细胞和卵母细胞分化期(S2)、滋养细胞快速增长期(S3)、卵母细胞快速增长期(S4)和卵子成熟期(S5)。该蜂的生殖细胞囊(cyst)由1个卵母细胞和15个滋养细胞,以及周围的滤泡细胞构成。细胞间主要通过F-actin为基础的细胞骨架连接,滋养细胞与卵母细胞通过营养管(nutritive appendix)相互连接。采用激光共聚焦显微技术、冷冻切片技术和细胞免疫定位技术研究表明,卵母细胞对Vg的摄取主要发生在S3时期,而滋养细胞中的细胞质转移到卵母细胞主要是发生在S4时期。TUNEL和PI双染色的结果表明,滋养细胞的凋亡始于S4前期,至S4中期,其大多数处于凋亡状态,到S4后期大部分滋养细胞已经死亡,只有少数尚处在凋亡状态。卵母细胞周围滤泡细胞的凋亡,始于S4后期。对S5时期卵子的电镜观察发现,其卵内主要含有卵黄颗粒和脂滴,卵壳的结构与其它昆虫相似,主要有卵黄膜、卵壳的内外层和基膜组成。 5.胚胎发育与卵黄蛋白的降解 蝶蛹金小蜂胚胎发育主要发生在寄生产卵后的36 h内,而在42 h,则开始孵化。对不同发育时期胚胎内蛋白的SDS-PAGE和Western免疫印迹分析发现,在寄生产卵后18 h内,Vt被降解成分子量较小的一些多肽,其中有9个多肽与Vt具有相似的抗原决定簇,能够被抗Vt的单克隆抗体所识别,其它小肽则不被识别,而在寄生产卵后24 h,胚胎内Vt完全被降解成不被抗体所识别的小肽。同时,胚胎内Vt含量在寄生产卵后12 h内,由刚产时的203 ng增加到12 h的359 ng,但12 h后快速减少,至42 h仅有57 ng,随后便检测不到。 6.卵黄发生的内分泌调控 蝶蛹金小峰成虫体内主要含有JHⅢ,其滴度在羽化后2 d内呈增长趋势,从刚羽化时的1.6pg/female增加到羽化后48 h的20 pg/female,此后,则开始减少,至羽化后第5 d,JHⅢ仅有25 pg/female。该蜂体内蜕皮激素的滴度在成虫羽化后急速减少,由刚羽化时的413 pg/female减少到12 h的175 pg/female,随后便开始增加,至羽化后24 h,体内蜕皮激素的滴度上升到234 pg/female,此后又快速降低。 采用不同浓度的JHⅢ(20 ng/♀、100 ng/♀和500 ng/♀)处理刚羽化雌蜂的结果表明,JHⅢ不能显著促进Vg的合成,但高浓度的JHⅢ(500 ng/♀)显著提高卵巢对Vg的摄取。雌蜂体内JHⅢ的滴度与卵巢内Vt存在显著的正相关,而与血淋巴中Vg和脂肪体中VgmRNA的含量相关性不显著。采用不同浓度的蜕皮激素(20-E)处理刚羽化雌蜂的结果表明,20-E能促进Vg的合成,但高浓度的20-E(25 ng/♀和125 ng/♀)显著抑制卵巢对Vg的摄取,而低浓度的20-E(5 ng/♀)对Vg的摄取无明显影响。该蜂体内20-E的滴度与脂肪体中Vg mRNA的含量存在显著的正相关,而与血淋巴中Vg和卵巢内Vt均无明显的相关性。刚羽化的雌蜂去头后,仍能完成卵黄发生与卵子成熟。 综合以上结果可以推测,蝶蛹金小蜂的卵黄发生主要受蜕皮激素调控,而保幼激素只是起到辅助作用。在蛹的后期和隐成虫期,蜕皮激素滴度的下降启动了脂肪体Vg mRNA的合成。一旦Vg的转录反应被启动后,Vg mRNA的合成便受到蜕皮激素的正调控。 7.营养和交配对卵黄发生与卵成熟的影响 喂食蜂蜜水不仅能够显著促进了蝶蛹金小蜂Vg的合成与摄取,而且显著提高了卵巢内卵子室数和成熟卵的比例。但是,取食蔗糖水和交配对卵黄发生的影响不明显。 8.脂肪体cDNA表达文库的构建与分析 以羽化后1 d雌蜂的脂肪体为材料,用ZAP Express~(?) Vector载体构建了一个cDNA表达性文库。该文库的原始滴度约为1×10~5 pfu/mL,扩增后的滴度约为1×10~8 pfu/mL,该文库的重组率约为95.82%,外源插入cDNA片段大小在0.5~2.5 kb之间。对随机挑取的重组克隆序列测定,初步获得103条ESTs序列,序列平均长度为600.74 bp。获得的ESTs序列主要包括细胞看家功能基因(65.5%)、信号转导相关的基因(12.5%)、基因转录和调控相关的蛋白(18.6%)。 9.Vg基因的克隆及其体内表达的分析 用抗Vt的单克隆抗体对脂肪体cDNA表达文库进行免疫筛选,从1×10~5个噬菌斑中获得了24个阳性克隆。对阳性克隆的序列测定,获得了该峰Vg的3端序列,约含有2530bp。用5 RACE的方法克隆了该蜂Vg的5端序列,并与前面测定的3端序列进行合并,获得了Vg cDNA的全序列。该序列含有5634 bp,编码1803个氨基酸,推测的分子量为202.94 kDa,等点PI=8.22,在GenBank中的登录号为EF468683。该序列含有4个推测的Vg酶切位点(RXXR),保守的结构区域GLCG和DGXR,同时在C-末端存在9个保守的半胱氨酸。通过Edman降解测定Vt1的N末端20个氨基酸位于Vg序列的第18~37氨基酸之间,因此推测前面的17个氨基酸为Vg的信号肽序列。 根据克隆的基因序列和该蜂保守的18S rRNA序列设计引物,建立了荧光定量PCR方法,并用来检测其体内Vg mRNA相对含量的变化。脂肪体中Vg mRNA从雌蜂的黑蛹期开始合成,但其相对含量较低,羽化时达到最高,且在羽化后12~24 h内维持较高的水平,随后则开始快速降低。雄蜂和雌蜂白蛹期的脂肪体中未检测到Vg mRNA。雌蜂血淋巴中Vg与脂肪体中Vg mRNA,不论是在某个特定时期,还是在总体上,都存在着显著的正相关,只是后者的出现约比前者提前了约24 h。 蝶蛹金小蜂Vg氨基酸序列与其它膜翅目昆虫具有较高的相似性,与丽蚜小蜂、日本瘤姬蜂、菜叶蜂、意大利蜜蜂、红火蚁Vg1、红火蚁Vg2、红火蚁Vg3分别为55.4%、40.7%、37.9%、35.4%、35%、32.7%、30.8%。此外,对40个物种Vg的分子进化分析表明,昆虫Vg的进化上基本上与其分类地位相一致。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 李凤真;李红岩;张士璀;;调节硬骨鱼卵巢发育和排卵的基因分析[J];鲁东大学学报(自然科学版);2011年03期
2 ;[J];;年期
3 ;[J];;年期
4 ;[J];;年期
5 ;[J];;年期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
11 ;[J];;年期
12 ;[J];;年期
13 ;[J];;年期
14 ;[J];;年期
15 ;[J];;年期
16 ;[J];;年期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李乾君;管致和;龚和;;家蝇Musca domestica卵黄发生及激素调控[A];北京昆虫学会成立四十周年学术讨论会论文摘要汇编[C];1990年
2 夏诗洋;李保平;孟玲;;蝶蛹金小蜂体型大小对交配行为的影响[A];公共植保与绿色防控[C];2010年
3 李嘉尧;赵云龙;;红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)卵黄发生的超微结构研究[A];中国海洋湖沼学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年
4 南春容;张海智;堵南山;赖伟;;中华绒螯蟹卵黄发生的超微结构研究[A];中国动物科学研究——中国动物学会第十四届会员代表大会及中国动物学会65周年年会论文集[C];1999年
5 李嘉尧;赵云龙;;红螯螯虾卵黄发生期间肝胰腺的显微与超微结构研究[A];中国海洋湖沼学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年
6 洪健;徐颖;;蝶蛹金小蜂成虫超微形态的SEM观察[A];走向21世纪的中国昆虫学——中国昆虫学会2000年学术年会论文集[C];2000年
7 王兰;;长江华溪蟹卵母细胞卵黄发生的超微结构研究[A];中国动物科学研究——中国动物学会第十四届会员代表大会及中国动物学会65周年年会论文集[C];1999年
8 杨小龙;高志华;刘敬泽;;蜕皮激素对长角血蜱卵黄发生的影响[A];中国动物学会北方七省市动物学会学术研讨会论文集[C];2005年
9 洪健;何黎平;;寄生蜂触角的扫描电镜样品制备技术[A];第三届全国扫描电子显微学会议论文集[C];2003年
10 陆剑锋;赵维信;;孕酮对克氏原螯虾甲基法尼酯生物合成的调控[A];第二届中国动物学会比较内分泌学分会和发育生物学分会联合学术研讨会论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 董胜张;蝶蛹金小蜂卵黄发生与卵子发生的生理与分子基础[D];浙江大学;2007年
2 吕慧平;蝶蛹金小锋卵巢发育和卵黄发生的影响因子及其作用[D];浙江大学;2002年
3 张忠;蝶蛹金小蜂和丽蝇蛹集金小蜂毒液的生化特性与生理功能[D];浙江大学;2005年
4 慎小晶;蝶蛹金小蜂cDNA文库抗菌肽基因筛选及表达研究[D];浙江大学;2010年
5 朱家颖;蝶蛹金小蜂毒液分子特性及其调控寄主分子机理的研究[D];浙江大学;2009年
6 杨小龙;长角血蜱卵黄发生及其激素调控[D];河北师范大学;2006年
7 王欢;蝶蛹金小蜂热激蛋白及其体内共生菌Wolbachia分子分型的研究[D];浙江大学;2009年
8 吴玛莉;蝶蛹金小蜂毒液的生理功能及活性成分分离纯化的研究[D];浙江大学;2008年
9 张倩倩;蝶蛹金小蜂寄生对菜粉蝶蛹细胞免疫与生理代谢的影响[D];浙江大学;2009年
10 崔青曼;中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)卵巢发育调控技术研究[D];南京农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 赵梦然;中华锯齿米虾卵黄发生的超微结构及免疫组化研究[D];河北大学;2009年
2 杨晓红;长角血蜱卵黄发生的激素调控[D];河北师范大学;2010年
3 何艳洁;长角血蜱孤雌生殖种群卵黄蛋白抗体的制备及卵黄发生的研究[D];河北师范大学;2011年
4 杨小龙;长角血蜱卵巢发育与卵黄发生的研究[D];河北师范大学;2003年
5 甘芳;养殖中华鲟卵黄发生研究[D];华中农业大学;2010年
6 陈洁;异色瓢虫对温度的适应性及其卵黄发生的初步研究[D];河北农业大学;2008年
7 赵允魁;龟足核型、白垩腺结构及卵子发生超微结构的研究[D];福建师范大学;2010年
8 王欢;2种金小蜂体内Wolbachia的wsp基因克隆与表达研究[D];西南大学;2006年
9 孟庆俭;外源激素对韭菜迟眼蕈蚊卵巢发育和脂肪体与卵巢中可溶性蛋白含量的影响[D];山东农业大学;2007年
10 李晓明;长角血蜱卵黄蛋白单克隆抗体的制备和卵黄发生的研究[D];河北师范大学;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978