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作物枯萎病生防细菌的研究

郝晓娟  
【摘要】: 枯萎病是一种毁灭性的土传病害,该病的生物防治已受到世界各国的极大关注。为获得优良性状生防菌直接为生产服务,本论文从菌种筛选鉴定、抑菌机理、安全性、发酵条件、定殖状况、抑菌物质分离提纯等方面对枯萎病的生防细菌进行了较系统的研究。 以番茄枯萎病病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici)为靶标菌,通过平板拮抗和温室盆栽防效相结合的方法从不同来源的土壤中筛选具有生防潜力的芽孢杆菌。从分离到的169株芽孢杆菌中筛选出具有拮抗作用的菌株15个,其中JK-2菌株对番茄枯萎病的盆栽防效和田间防效分别达到83.82%和74.70%,抑菌能力最强。通过生理生化特征和16S rDNA序列比较、脂肪酸(FAME)分析,JK-2菌株被鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。电镜观察结果表明,JK-2主要通过拮抗作用来抑制枯萎病菌在番茄根部的侵染。JK-2可造成枯萎病菌菌丝消解、产生泡状物、破坏生长点、引起细胞内含物外溢及降低孢子萌发率。JK-2对寄主植物没有致病性;对小白鼠的半致死量LD_(50)>2000mg·kg~(-1);接种JK-2菌株30d后,番茄根际土壤中细菌和放线菌数量的变化均末达到极显著水平,而真菌数量明显下降,初步表明了该菌株安全性较高,符合生物杀菌剂的要求。通过正交优化试验获得的最适宜JK-2抑菌物质产生的发酵配方为:淀粉1.0%、牛肉膏0.5%、蛋白胨0_3%、蔗糖1.0%、酵母粉0.5%,CaCl_20.5%,初始pH7.0。JK-2产生的抑菌物质粗提物对蛋白酶不敏感,耐强酸强碱,紫外线和反复冻融对其活性也没有显著影响。在定殖试验中成功获得了具GFP标记和红霉素抗性的转化子JK-2-gfp,JK-2-gfp菌株可通过灌根接种的方法在自然土壤中成功定殖,其在土壤中的含量为10~4-10~6cfu/g,接种60天后仍可在士壤中分离到JK-2-gfp菌株。本试验从JK-2发酵液中提取出了分子量约为4.1kD的活性肽和具有抑制枯萎菌活性的胞外多糖,短短芽孢杆菌产生对病原真菌具拮抗活性的多糖物质在国内外尚属首次报道。 本研究同时对福建漳州香蕉植株的内生细菌进行了分离和拮抗细菌的筛选。首次在国内开展了香蕉健康植株和罹患枯萎病植株中内生细菌分布规律的比较研究。统计分析结果表明,健株体内细菌总量显著高于病株;健株中除地下球茎、叶柄部位的内生细菌数量与病株相比不存在显著差异外,其余各部位的内生细菌数量均显著高于病株;健株和病株内生细菌在种群数量分布上存在差异;分离到的16个内生细菌种群中,在健株中没有分离到巨大芽孢杆菌(B. megaterium),而在病株中没有分离到Acinetobacter baumannii和Microbacterium chocolatum。从分离到的411株香蕉内生细菌中筛选出35株对尖孢镰刀菌香蕉专化型(F. oxysporum f. sp. cubense)具有抑制作用的拮抗细菌,占供试菌株总数的8.52%。最后筛选到的8株能够产生稳定抑菌圈的菌株中有6株分离自健康植株,经鉴定有5株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、2株为恶臭假单胞菌(P. putida)、1株为生枝动胶菌(Zoogloea ramigera),其中铜绿假单胞菌H4-3-1菌株抑菌活性最强。抑菌谱试验结果表明H4-3-1菌株对番茄、香蕉、西瓜、甜瓜、辣椒枯萎病病原菌、番茄灰霉菌、油菜菌核菌等均有良好的离体拮抗效果。电镜观察结果表明,H4-3-1菌株能使番茄枯萎菌菌丝扭曲变形、细胞壁破裂、纠集成团停止生长,但对孢子萌发的抑制作用不大。H4-3-1菌株代谢产物可显著促进胚轴和根的生长,在盆栽试验中,H4-3-1菌悬液对番茄出苗具有显著的促进作用,对番茄苗株高、根长和鲜重也有不同程度的促进作用。由于H4-3-1菌株菌体数量与抑菌活性不呈正相关,需考虑实际需要来选择发酵条件,其中抑菌活性物质产生的最佳培养条件为:NA培养液初始pH为7.0,装液量25ml/250ml三角瓶,30℃下振荡培养24h。H4-3-1产生的抑菌物质可以被饱和度为70%的硫酸铵完全沉淀下来,初步判断该物质为大分子蛋白,该物质具有耐热、耐酸碱、耐蛋白酶、耐紫外线等特点,具有研究开发的价值。通过对H4-3-1进行抗Rif突变株筛选,得到能在含350μg/mlRif的NA固体培养基上稳定生长的突变菌株用于定殖试验。H4-3-1菌株通过浸种、灌根等体外接种方法均可进入其自然寄主香蕉和非自然寄主番茄、西瓜、甜瓜等植株体内定殖或短时间定殖,表明H4-3-1没有寄主专一性的限制,具有较为广泛的寄主。


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