Bt毒蛋白在“转Bt水稻—稻纵卷叶螟—纵卷叶螟绒茧蜂”食物链中的传递和作用机制

【摘要】： 水稻作为人类主要口粮之一，转基因水稻安全性倍受关注，有关转基因水稻生态安全性研究尤为必要。因此，在转基因水稻商业化生产之前，进行系统、科学的生态安全性评价刻不容缓。本论文以转crylAb基因粳稻纯合品系“克螟稻1号(KMD1)”和“克螟稻2号(KMD2)”为材料，通过室内外实验，评价了转基因抗虫水稻对靶标生物稻纵卷叶螟及其天敌纵卷叶螟绒茧蜂的生态安全性影响以及对稻田生境内节肢动物群落多样性的影响。结果如下： 1转crylAb基因抗虫粳稻对靶标害虫稻纵卷叶螟取食、生长及存活的影响 连续取食转crylAb基因的水稻后，不同龄期的稻纵卷叶螟幼虫食物的消耗量都显著的低于取食对照水稻“秀水11”的幼虫的消耗量。稻纵卷叶螟幼虫在对照水稻“秀水11”上连续取食时，食物的消耗量随着时间的延长而增加。当幼虫取食转Bt基因的水稻“KMD1”时，不同龄期的变化趋势有所不同，3龄幼虫取食水稻的食物消耗量随时间的变化也有所不同于4龄和5龄，3龄幼虫在取食后食物消耗量有先减再稍微增的趋势，而4龄和5龄老熟的幼虫则表现为先增加再略微减少的趋势。取食转crylAb基因的水稻后，稻纵卷叶螟3龄，4龄和5龄的幼虫体重都出现了负增长的趋势，取食对照水稻“秀水11”的幼虫则表现出体重的正增长。取食转Bt基因的水稻后，稻纵卷叶螟3龄，4龄和5龄的幼虫分别都表现出了较高的相对死亡率，其中3龄，4龄和5龄幼虫在取食转Bt基因水稻72小时后的相对死亡率分别为81％，77％和68％。表明低龄幼虫比高龄幼虫对转Bt基因水稻显得更加敏感。 2转crylAb基因抗虫粳稻对靶标害虫稻纵卷叶螟组织病理学效应 稻纵卷叶螟幼虫取食了转CrylAb基因的水稻后，中肠上皮细胞的线粒体先发生形态变化，随取食时间的延长，线粒体出现凝聚、内嵴破坏、空泡化等。内质网的变化也很明显，病变过程中伴随着粗糙内质网的肿胀、核糖体脱落等。此外，在病变过程中，细胞质内出现了粗糙内质网增多等现象。组织病变程度不一，有的细胞在病变早期就出现了空泡化。细胞核的变化较小，在处理后期出现细胞核拉长、核仁聚集等变化。杯状细胞的杯腔底部的细胞质突起变化很明显，表现为突起拉长，脱落成膜性结构，最后破碎，消失，线粒体则呈凝聚态随突起脱落或沿杯腔边沿单一排列。 3转crylAb基因抗虫粳稻对靶标害虫稻纵卷叶螟中肠血淋巴糖代谢和蛋白质浓度的影响 取食转crylAb基因水稻的稻纵卷叶螟幼虫，在取食12h，24h，36h后的5龄幼虫血淋巴的浓度显著低于对照，3龄幼虫和5龄幼虫其他取食时间的血淋巴的总蛋白浓度均低于取食对照水稻“秀水11”的幼虫血淋巴总蛋白浓度，但差异不显著。取食转Bt基因水稻的稻纵卷叶螟幼虫无论是3龄幼虫还是5龄幼虫血淋巴总糖含量均低于取食对照水稻秀水11，差异不显著。取食转Bt基因水稻的稻纵卷叶螟幼虫无论是3龄幼虫还是5龄幼虫血淋巴海藻糖的含量也均低于取食对照水稻“秀水11”的幼虫血淋巴中海藻糖含量，但差异不显著。 4转crylAb基因抗虫粳稻对靶标害虫稻纵卷叶螟中肠蛋白酶活性的影响 稻纵卷叶螟3龄幼虫在取食转crylAb基因水稻“KMD1”12h、24h、36h和48h后中肠总蛋白酶活性比对照有所上升，取食60小时后的总蛋白酶活性比对照低；在取食“KMD2”时，在12h和48h后比对照略升，而36h和60h后则比对照下降，取食24h后无明显变化。5龄幼虫在取食转Bt基因水稻“KMD1”12h、24h、48h和60h后中肠总蛋白酶活性比对照有所上升，取食36小时后的总蛋白酶活性和对照相近；在取食“KMD2”时，在12h、36h、48h和60h后比对照略升，而取食24h后比对照略为下降。 稻纵卷叶螟3龄幼虫在取食转crylAb基因水稻“KMD1”、“KMD2”分别在12h、24h、36h、48h和60h后中肠强碱性类胰蛋白酶活性比对照都有所下降，但无明显差异。5龄幼虫除了取食“KMD1”在36h后和取食“KMD2”60h后蛋白酶活性有上升外，其余时间均表现为下降。 弱碱性类胰蛋白酶活性以及类胰凝乳蛋白酶活性的变化与强碱性类胰蛋白酶活性变化相似，大部分时间段均呈现下降的趋势，除了弱碱性类胰蛋白酶活性在幼虫3龄取食“KMD1”12h和24h后，5龄取食“KMD2”48h后有所上升，以及类胰凝乳蛋白酶活性在幼虫3龄取食“KMD1”12h后，5龄取食“KMD2”24h，36h，60h后有所上升。 5纵卷叶螟绒茧蜂对转crylAb基因水稻及稻虫复合体挥发物的行为反应 在转crylAb水稻“KMD1”和对照水稻“秀水11”之间，纵卷叶螟绒茧蜂选择转基因水稻较多，但差异不显著，在另一转基因水稻“KMD2”上则表现明显的偏好。在转基因水稻或对照水稻和2龄稻纵卷叶螟幼虫的复合体中，纵卷叶螟绒茧蜂极显著选择对照和2龄稻纵卷叶螟幼虫的复合体。在转基因水稻或对照水稻和4龄稻纵卷叶螟幼虫的复合体中，纵卷叶螟绒茧蜂也是极显著选择对照和4龄稻纵卷叶螟幼虫的复合体。 6转crylAb基因抗虫粳稻对纵卷叶螟绒茧蜂生物学特性的影响 寄生在取食转基因水稻“KMD1”和“KMD2”的稻纵卷叶螟幼虫体内的纵卷叶螟绒茧蜂，其卵+幼虫历期与对照无明显差异，2龄寄主育出的雄蜂、雌蜂的寿命都明显短于对照，3龄寄主育出的只有雄峰的寿命明显短于对照。两个龄期寄主育出的绒茧蜂出茧率和羽化率都明显的低于对照；茧长与对照无明显差异；2龄寄主育出的蜂茧重与对照无明显差异，3龄寄主育出的蜂茧重明显低于对照；蜂重无论雌雄都显著低于对照：2龄寄主育出的雌雄蜂前翅长与对照无明显差异，而3龄寄主育出的雌雄蜂前翅长均显著低于对照。 7 Bt毒蛋白在“转Bt基因水稻—稻纵卷叶螟—纵卷叶螟绒茧蜂”食物链中的传递 ELISA结果表明，不同生育期“KMD1”和“KMD2”水稻叶鞘内均含有CrylAb杀虫蛋白，“KMD1”和“KMD2”在不同生育期间存在差异，其中苗期、分蘖期和孕穗期叶鞘内CrylAb杀虫蛋白的含量显著高于黄熟期。“KMD1”和“KMD2”上取食的稻纵卷叶螟幼虫整体中则可以检测到毒蛋白的存在。在取食“KMD1”的连续5天内，其体内的CrylAb杀虫蛋白含量表现出先下降再略上升的趋势。而在“KMD2”上，第3天的变化趋势和“KMD1”相反，其他基本一致，但均无显著差异。同时，在纵卷叶螟绒茧蜂幼蜂体内也检测到了CrylAb杀虫蛋白的存在。并且随着稻纵卷叶螟取食Bt水稻时间的延长，体内的毒蛋白有逐渐下降的趋势。单头纵卷叶螟绒茧蜂中毒蛋白的含量明显低于单头稻纵卷叶螟幼虫体内的含量。同时，我们也检测了解剖的稻纵卷叶螟幼虫的血淋巴、稻纵卷叶螟幼虫整体以及稻纵卷叶螟幼虫排泄物中杀虫蛋白的含量。随着取食时间的延长，稻纵卷叶螟幼虫的血淋巴、稻纵卷叶螟幼虫以及稻纵卷叶螟幼虫排泄物中杀虫蛋白的含量没有上升的趋势，反而有一定的下降。 8转Bt基因水稻对稻田生境内节肢动物群落多样性的影响 在3年3地点的调查中，Bt稻田和对照田间节肢动物物种总数没有明显差异，在杭州试验田中，Bt水稻(B系列)上节肢动物的物种总数略少于对照田块，但差异不显著；在建德试验田中，Bt水稻(TT系列)上节肢动物物种总数略高于对照田块，差异也不显著；富阳试验田块中Bt水稻(K系列)上节肢动物物种总数与对照田无明显差异。Bt水稻田和对照田在各参数上(丰富度，多样性指数，优势集中性指数和均匀度)均没有明显的差异。在功能团优势度上，除了03年杭州试验田外，其他试验田中群落中的植食性功能团占显著优势，寄生性功能团和腐食性功能团其次，在整个功能团组成上Bt稻田和对照田间没有明显差异。