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猪α-干扰素基因的原核表达及活性分析

韩森  
【摘要】: 病毒性传染病是困扰我国养猪业发展最突出的问题,每年因病毒感染引起猪死亡和生长障碍造成了巨大的经济损失。干扰素(interferon,IFN)是由机体细胞产生的一类高活性多功能糖蛋白,具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性及免疫调节等多种功能。其中又以α-干扰素的广谱抗病毒作用最为显著,利用基因工程技术获得具有生物学活性的重组猪α-干扰素对猪病毒病的防治具有重要的意义。本研究在克隆猪α-干扰素基因的基础上,在大肠杆菌和枯草杆菌两种原核表达系统中分别进行了猪α-干扰素的表达,并分析了重组表达产物的活性,获得如下主要结果: 1)根据GenBank上猪α-干扰素基因序列(M28623),设计了一对克隆引物5Pinf和3Pinf,以长白猪肝脏基因组为模板,采用PCR方法扩增得到了猪α-干扰素全长基因片段,并将其与克隆载-体连接,获得重组克隆质粒pGEM-PoIFNα。测序结果表明,猪α-干扰素基因全长681bp,其中开放阅读框架长570bp(51-620),编码189个氨基酸残基,N端前23个氨基酸残基为信号肽序列,干扰素成熟肽由166个氨基酸组成,理论分子量为19.0kDa。 2)设计了一对用于猪α干扰素原核表达的引物5Eifn和3Eifn,并分别引入了EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点,以重组质粒pGEM-PoIFN为模板,对猪α-干扰素基因进行亚克隆,并将其定向插入融合表达载体pET-30a,经转化和筛选获得了含重组表达质粒pET-PoIFNα的基因工程菌E.coli[pET-PoIFN]。SDS-PAGE蛋白质电泳显示,重组猪α-干扰素基因以包涵体形式表达,目的蛋白大小约为24kDa,与融合表达产物的理论分子量接近。ELISA分析显示,重组猪α-干扰素可与小鼠抗猪α-干扰素单克隆抗体结合,这进一步证实了猪α-干扰素基因在大肠杆菌中成功表达。 3)设计了一对用于猪α-干扰素基因在枯草杆菌中表达的引物5Bifn和3Bifn,并分别引入了SalⅠ和XbaⅠ酶切位点,对猪α-干扰素基因亚克隆并定向插入表达载体pBES1,经转化和筛选获得含重组表达质粒pBES1-PolFNα的基因工程菌,命名为B.subtilis[pBES1-PoIFN]。 4)大肠杆菌中表达的重组猪α-干扰素包涵体经变性、复性处理后测定其活性,结果表明,复性后的干扰素对人肝癌细胞增殖具有抑制效果,但没有抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性。枯草芽孢杆菌表达的重组猪α-干扰素也无抗病毒效果。 以上研究结果为获得有活性的重组猪α-干扰素及其在养猪业中的应用提供了基础。


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