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对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28基因的表达及其重组蛋白抗病性研究

杜华华  
【摘要】: 对虾白斑综合征(WSS)是全球对虾养殖业所面临的危害性最大的病害之一,至今已席卷了世界各国的对虾养殖地区,造成了巨大的经济损失。但目前尚无有效的防治手段。因此,预防和控制疾病方面的研究正成为热点。本研究主要在大肠杆菌和昆虫杆状病毒表达系统中表达了对虾白斑综合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白VP28,比较了原核表达产物和真核表达产物保护克氏原螯虾抵抗WSS的效果。主要研究内容和结果如下: 1)用蔗糖垫层差速离心法从人工感染的螯虾中分离纯化了WSSV。完整病毒粒子长约360~420nm,直径约80~120nm,而核衣壳长约320~400nm,直径约80~90nm。通过对纯化的WSSV进行SDS-PAGE分析发现至少存在12个大小不同的蛋白条带。这与报道的结果相似,说明本研究所分离的病毒确实是WSSV。 2)利用PCR技术,扩增和克隆得到了完整的囊膜蛋白VP28基因(GenBank登录号为DQ098011),基因序列全长为615bp,编码204个氨基酸。与已登录GenBank的几个不同地理分离株的同源性均在99%以上。通过对预测的204个氨基酸进行DNATools 5.1分析表明VP28基因序列存在多个可能的糖基化位点。 3)VP28基因在大肠杆菌中进行表达,并用Ni-NTA柱纯化后,分别用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白分析。结果显示其表达产物均出现了明显的特异性条带,而且大小与预测的一致,表明VP28基因在大肠杆菌中进行了有效的融合表达。但重组得到的VP28蛋白分子量比在纯化病毒中分离得到的蛋白分子量小,暗示着在大肠杆菌中重组VP28蛋白得不到转译后的修饰。 4)为获得与天然结构相近的表达产物,本研究采用了Bac-to-Bac杆状病毒表达系统。VP28基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA后,经转座形成重组Bacmid-VP28。提取重组Bacmid-VP28 DNA转染Sf9昆虫细胞进行表达。表达产物分别用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白分析。结果表明,VP28基因在昆虫细胞中进行了有效的表达。重组得到的VP28蛋白分子量比理论推导的分子量大约6kDa,但与在纯化病毒中分离得到的蛋白分子量大小一致,这暗示着在昆虫细胞中表达的重组VP28蛋白得到了转译后的修饰。 5)在摸索WSSV感染螯虾的水温条件时发现在18℃~28℃之间,随着水温的升高,死亡率也有增大的趋势。但高水温(30℃)能抑制WSSV对螯虾的侵袭。竞争性PCR分析结果表明在室温(24±1℃)条件下WSSV的病毒拷贝数从感染后12h的10~4/mg迅速上升到96h的10~(10)/mg,而在高温(32±1℃)条件下WSSV的病毒拷贝数却一直保持在10~5/mg左右。这说明高温并没有清除患病螯虾体内的病毒粒子,而只是抑制了病毒的复制。 6)为了研究囊膜蛋白VP28的结构是否对其抗病性产生影响,从大肠杆菌表达获得的重组VP28蛋白(pET-VP28)和从昆虫细胞表达的重组VP28蛋白(AcNPV-VP28)分别通过肌肉注射免疫螯虾。10d后注射一定浓度的WSSV进行攻毒,然后通过记录死亡率来评估VP28蛋白的保护效果。试验结果表明,AcNPV-VP28免疫的螯虾死亡率与其对照组AcNPV相比,平均相对存活率(RPS)达89%,而pET-VP28免疫组与对照组pET-30a相比,平均RPS仅为35%。这一结果表明注射免疫重组囊膜蛋白VP28能诱导螯虾产生抗病毒作用,而且从昆虫细胞中表达获得的重组VP28蛋白的抗病性要明显好于从大肠杆菌中获得的重组VP28蛋白。这暗示着可能存在的转译后修饰从而折叠正确的蛋白抗原能给螯虾带来更强的免疫反应,从而产生更好的抗WSSV保护作用。


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