收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

鸭白细胞介素2配体与受体alpha的研究

王金勇  
【摘要】: 基于鸡白细胞介素2(chIL-2)全基因序列设计引物探针,以简易基因组抽提法获得的鸭外周血单核细胞基因组DNA为模板,用长距离聚合酶链式反应(LD-PCR)扩增鸭白细胞介素2(duIL-2)全基因片段,得到的duIL-2基因组DNA序列全长为3528bp。运用生物信息学方法对duIL-2的基因结构、启动子结构和预测的成熟蛋白进行系统分析,在此基础上对推测的duIL-2蛋白的三维结构分子模型进行了构建。结果表明:duIL-2基因具有典型的4外显子3内含子结构,与已知的鸡和哺乳类同系物基因总体结构具有明显的相似性;鸭和鸡及其它哺乳动物IL-2基因的启动子序列具有显著的保守性,都具有AP-1,NF-AT,CD28RE,OCT,TATA box转录起始因子结合位点和预测的转录起始位点;推测的duIL-2基因的阅读框长420bp,编码一条由140个氨基酸组成的多肽;duIL-2基因推测的成熟蛋白进化分析表明,鸭和鹅的亲缘关系最近,和哺乳动物的亲缘关系比较远,显示出明显的种属差异;三维结构预测表明,duIL-2蛋白具有典型的四alpha螺旋捆绑结构。 以RT-PCR方法克隆的鸭白介素2的cDNA为模板,PCR扩增鸭IL-2成熟蛋白的编码序列。将此序列插入pBAD/HisB和pET28a原核表达载体多克隆位点,构建pBAD/HisB-duIL-2和pET28a-duIL-2重组子,分别转化大肠杆菌LMG194和BL21(DE3)宿主菌,经阿拉糖和IPTG诱导,实现了鸭白介素2蛋白(rduIL-2)体外重组表达。SDS-PAGE分析显示,表达蛋白的分子量约分别为18.7KDa和14.6KDa。Western Blot分析表明,表达的重组蛋白能分别被anti-Xpress和anti-His单克隆抗体识别。以pET28a系统表达的rduIL-2蛋白为原材料,尝试了两种复性策略制备复性rduIL-2蛋白结构单体:一种是借助梯度稀释对变性纯化的rduIL-2单体进行复性;一种是借助FPLC对非变性纯化的rduIL-2单体进行简易氧化复性。前者的复性产物中含有rduIL-2多聚体和单体两种形式,且产率很低。后者可以获得高产量的复性单体。PF-2D分析表明复性单体等电点为3.4,反相二维色谱没有分离到潜在的异构体。非变性条件制备的rduIL-2复性单体4℃存放一周没有形成沉淀,而变性复性策略获得复性产物则形成可见絮状沉淀。 以纯化的rduIL-2免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞筛选,有限稀释法克隆,成功获得5株能分泌抗鸭IL-2蛋白的单克隆抗体(mAb)细胞系:1H4、283、4G12、5F6和5H6。除mAb 5H6为IgG2a亚类外,其余4株mAb类型均为lgG1亚类,5株mAb的轻链都为κ链。Western-blot分析表明,所获得的5株抗鸭IL-2单克隆抗体与鸭IL-2具有反应性,其中5H6对鸡IL-2具有交叉反应性。细胞免疫化学分析表明,单克隆抗体283、4G12、1A4以及多抗均能够识别真核细胞瞬时表达系统表达的鸭重组IL-2。体外阻断实验证明,mAb 2B3能够明显抑制duIL-2对鸭脾细胞的增殖效应。 以rduIL-2复性单体为活性标准品,进行了鸭白介素2体内外生物学活性研究:用MTT法测定了rduIL-2的体外淋巴细胞增殖活性;以鸡为模型,静脉注射rduIL-2,观察其体内生物学效应;研究了rduIL-2蛋白对重组禽流感灭活疫苗免疫效力的影响。结果表明:rduIL-2复性单体能刺激T淋巴细胞增殖,且呈剂量依赖性;高剂量连续注射rduIL-2引起鸭发热、多脏器炎症等毒副作用;鸡静脉注射低rduIL-2(0.1-25μg)后,其CD4~+T细胞上调,且上调水平与注射剂量没有直接相关性,而CD8~+T细胞含量变化不明显。低剂量的鸭IL-2能够明显提高重组禽流感灭活疫苗HI效价,而剂量过高则会抑制重组禽流感灭活疫苗免疫效力。 根据鸡白介素2受体alpha链(ChlL-2Rα)cDNA序列设计多对引物探针,结合RACE技术克隆了duIL-2受体alpha cDNA(命名为DuCD25或者duIL-2Rα)。克隆的cDNA序列长886bp,其cDNA编码一条由226个氨基酸组成的前体蛋白,该前体蛋白含有由20aa残基构成的信号肽序列;预测的duIL-2Rα成熟蛋白与鸡IL-2Rα同源性61%,与哺乳类同系物同源性在15-25%之间。对10个物种IL-2Rα氨基酸序列分析发现,禽类和哺乳类有23个aa对应位点完全保守。duIL-2Rα的8个半胱氨酸残基中,有7个对应位点与鸡和哺乳类完全保守;我们也发现,哺乳类IL-2Rα的P24-P25、N90-A91、P111-K112、1185-R186位点之间和胞内羧基末端,在进化过程中分别出现了1、3、1、26-29和9-16个氨基酸插入现象,然而在进化过程中,哺乳类IL-2Rα并没有发生任何aa残基缺失的现象。二级结构分析表明,duIL-2Rα成熟蛋白羧基末端含有25个氨基酸残基(182-206)构成的跨膜区。 将duIL-2Rα胞外链PCR产物亚克隆入原核表达载体pET32a,构建重组表达载体pET32a-duIL2Rα,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导实现了duIL2Rα蛋白在大肠杆菌的表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示,表达蛋白的分子量约为40KDa,可以被anti-His单克隆抗体识别。可溶性分析表明,经pET32a系统表达的duIL-2Rα主要以包涵体的形式存在。表达的重组蛋白经Ni~(2+)层析柱变性纯化产率极低,采用制备包涵体的方法,每升培养液中可获得32mg rduIL2Rα蛋白粗制品。 用纯化的rduIL-2Rα包涵体蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合,杂交瘤细胞筛选,有限稀释法克隆,最终获得15株持续、稳定分泌抗rduIL-2Rα原核表达产物的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为1A4,3B6,7C8,1C5,3D1,1E4,2E1,6E1,6E9,2F4,6F2,4G10,3H11,4H3,6H7(抗体类型均为IgG1,κ)。对15株单抗Western blot鉴定结果表明,与rduIL-2Rα均具有反应性。细胞免疫化学分析表明,仅有5株(1A4,3H11,4G10,3D1,6F2)能够特异识别经Vero细胞瞬时表达的duIL-2Rα蛋白。进一步利用Con A诱导的内源性duIL-2Rα作为抗原,筛选到两株能够识别duIL-2Rα天然表位的抗体(3H11,6F2)。 利用H9N2亚型禽流感病毒感染模型,以rduIL-2 Rα单克隆抗体6F2为检测抗体,借助流式细胞术,研究了鸭DuCD25~+细胞在病毒感染免疫应答中的表达动态。结果表明,健康鸭脾细胞仅有少量DuCD25~+细胞(<4%),而感染鸭脾细胞中的DuCD25~+细胞比率以固定斜率直线式迅速上调,到48h达到峰值,随后逐渐下降,至感染后144h降至正常水平,说明DuCD25~+细胞在机体抗病毒感染的免疫应答过程中扮演着重要角色。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 郭志儒;香港再次发生禽流感病毒感染人[J];中国兽医学报;2003年02期
2 杨瑞富;冬春季注意防治禽流感[J];四川农机;2003年01期
3 ;禽流感突如其来荷兰鸡遭受灭顶之灾[J];动物科学与动物医学;2003年03期
4 叶国安;香港连年暴发烈性禽流感给我们的警示[J];养禽与禽病防治;2003年07期
5 武晓宏,周战江,闫忠耀;禽流感的诊断和防治[J];宁夏农林科技;2003年06期
6 曹惠良,沈瑞玲;禽流感流行特点及防制[J];福建农业;2003年02期
7 顾云飞;由禽流感爆发引发的思考[J];黑龙江畜牧兽医;2004年04期
8 ;哪些消毒剂能有效杀灭禽流感病毒?如何使用?[J];内蒙古林业;2004年04期
9 李路;禽流感[J];农业科技通讯;2004年06期
10 ;禽流感问答[J];西南民兵;2004年02期
11 吴祥辉 ,王桂朝;大家论坛——禽流感防制的新视点[J];中国家禽;2004年12期
12 ;低温下的禽流感病毒能存活更长时间[J];饲料与畜牧;2004年06期
13 魏秀俭,李晓鹏;禽流感病毒概述[J];聊城大学学报(自然科学版);2004年03期
14 ;禽流感病毒在鸭身上变异后更危险[J];中国家禽;2004年13期
15 王小芬;禽流感的危害与防制[J];黄冈职业技术学院学报;2004年04期
16 吴长德,赵德明,韩彩霞,宁章勇,方永辉;气候对禽流感爆发的影响[J];吉林畜牧兽医;2004年07期
17 陈连颐;禽流感疫情走了,我们还应做什么[J];中国禽业导刊;2004年10期
18 籍玉川,高显明;禽流感的回顾与反思[J];动物医学进展;2005年10期
19 范宗理;鸭子可扩大禽流感病毒传播的危险性[J];自然杂志;2005年03期
20 ;哪些消毒剂能有效杀灭禽流感病毒?[J];家禽科学;2005年11期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 孙恩泽;谢敏;赵海粟;黄碧海;刘书琳;张万坡;张志凌;王汉中;庞代文;;量子点标记禽流感病毒[A];第六届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2009年
2 黄志坚;陈强;李清禄;王寿昆;江和基;;不同消毒剂对禽流感病毒的杀灭试验[A];福建省科协第八届学术年会分会场“转变饲养方式,促进海西畜牧业和谐发展”学术年会论文集[C];2008年
3 周祖华;张敏;程礼明;徐彬;沈彩信;;禽流感流行趋势分析[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年
4 韦婷;胡杰;兰彬;陆文俊;苏凯;覃芳芸;;广西暴发中低毒力禽流感情况报告[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年
5 于康震;付朝阳;崔尚金;步志高;唐秀英;;我国禽流感防制研究进展[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年
6 杨爱梅;陈福勇;;禽流感病毒HA基因的克隆和测序[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年
7 黄韧;刘忠华;刘香梅;;应用RT-PCR技术检测H_5N_1型禽流感病毒[A];中国实验动物学会第六届学术年会论文集[C];2004年
8 崔尚金;李曦;童光志;;禽流感发生的流行病学分析[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集(下册)[C];2004年
9 张鹤晓;赖平安;刘环;刘继红;郭晋优;谷强;张利峰;汪琳;段生涛;张向东;朱文斯;杨伟;李宁;;荧光RT-PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集(下册)[C];2004年
10 杨小燕;;禽流感与公共卫生[A];第六届全国会员代表大学暨第11次学术研讨会论文集(上)[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 邹镇;H5N1型禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒致急性呼吸损伤的机理研究[D];北京协和医学院;2012年
2 崔尚金;我国禽流感的流行病学调查[D];中国农业科学院;2005年
3 李志萍;H5N1亚型禽流感病毒实验全过程实验室微环境集群监测和评价[D];吉林大学;2012年
4 侯小强;促炎细胞因子及p53蛋白在哺乳动物禽流感致病中的作用研究[D];吉林大学;2010年
5 张文韬;基于量子点的禽流感病毒检测新方法探索[D];武汉大学;2010年
6 孟庆文;逆转录病毒介导的特异性反义RNA和核酶抑制禽流感病毒复制的研究[D];中国农业科学院;2001年
7 彭伏虎;禽流感与新城疫胶体金免疫层析快速检测技术及初步应用研究[D];华中农业大学;2008年
8 程凯慧;H6N1亚型禽流感对哺乳动物的传播与致病机制研究[D];石河子大学;2013年
9 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
10 范胜涛;野鸟禽流感监测及哺乳动物跨种传播能力评估[D];北京协和医学院;2014年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王馥梅;禽流感病毒核蛋白的真核表达及蛋白芯片检测技术初步研究[D];中国农业科学院;2010年
2 宫爱艳;鸡源抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库的构建研究[D];西南农业大学;2005年
3 杨若松;H5N1亚型禽流感病毒HA基因在马立克病毒上重组体的构建[D];河北农业大学;2006年
4 王爱琴;H5N1亚型禽流感病毒NS1149位氨基酸对生物学功能的影响[D];内蒙古农业大学;2006年
5 刘芳芳;抗流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定[D];华中农业大学;2006年
6 孙培录;狐狸源H5N1亚型禽流感病毒的分离与鉴定[D];吉林大学;2008年
7 杨会娜;液体电谐振传感仪在诊断禽流感上的应用研究[D];重庆理工大学;2011年
8 王少振;H5N1亚型禽流感病毒NA1基因的克隆与原核表达的研究[D];福建农林大学;2009年
9 何春燕;表达虎源H5N1亚型禽流感病毒NP蛋白重组犬2型腺病毒的构建与鉴定[D];四川农业大学;2009年
10 梁立滨;H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠肺组织差异蛋白质组学分析[D];中国农业科学院;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 李杨;禽流感疫情不会长期影响农产品期价[N];金融时报;2005年
2 新华社记者 栾海 张忠霞;亚洲:在摸索中共同抗击禽流感[N];新华每日电讯;2004年
3 崔尚金 博士后;禽流感病毒“发威”变得异常“敏感、凶悍”[N];中国畜牧兽医报;2006年
4 本报记者  王波;禽流感“二次来袭”与气候有关[N];21世纪经济报道;2006年
5 葛秋芳;伊拉克被证实出现猫感染禽流感病例[N];新华每日电讯;2006年
6 李江涛;我科学家发现:禽流感病毒可母婴传播[N];新华每日电讯;2007年
7 本报综合报道;禽流感让整个欧洲都“戴上了口罩”[N];中国经济导报;2005年
8 赵继勋 教授;科学面对“禽流感”[N];中国畜牧报;2004年
9 记者 徐京跃 张晓松 何德力;中国完全能控制和扑灭禽流感疫情[N];新华每日电讯;2004年
10 新华社记者 张锦芳;对禽流感,人类所知还有限[N];新华每日电讯;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978