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高效降解棉酚菌种的选育及棉籽饼粕生物发酵的研究

张文举  
【摘要】: 棉籽饼粕富含蛋白质,是很好的植物蛋白饲料资源。但因其含有对动物有毒的游离棉酚,其利用价值和使用量受到极大限制。为此,人们研究了许多脱毒方法,如有机溶剂浸提、硫酸亚铁处理、氢氧化钙处理以及微生物发酵等方法。这些方法在棉籽饼粕脱毒方面起到了重要作用,但有机溶剂浸提法存在有机溶剂残留问题,对动物有潜在的危害;硫酸亚铁处理影响饲料品质和降低采食量;氢氧化钙处理脱毒效率相对较低。微生物发酵法是一种有发展前景的方法,该法不但能脱除棉籽饼粕中的棉酚,而且还可以提高棉籽饼粕的蛋白质含量,发酵底物中存留许多酶类(微生物分泌,如纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂解酶)、维生素、氨基酸以及一些促生长因子,因而受到了广泛重视。 本课题通过选育高效降解棉酚的菌株,优化发酵工艺参数,探讨影响发酵脱毒效果的因素,考察复合发酵脱毒效果及其影响因素等途径来研究棉籽饼粕生物发酵效果。 通过醋酸棉酚无糖查氏培养基和醋酸棉酚麦芽汁培养基平板筛选和培育技术,并利用棉籽饼生物发酵的方法,选育出一株对棉酚具有较高脱毒率的菌种热带假丝酵母ZD-3(Candida tropicalis ZD-3)。热带假丝酵母ZD-3细胞呈卵圆形,大小为3~4×4~5μm,出芽繁殖。用麦芽汁液体培养该菌,菌体沉淀于管底。平板培养菌落有皱纹,可形成假菌丝。热带假丝酵母ZD-3不能在半厌氧条件下发酵棉子糖以及在好氧条件下同化利用棉子糖,因此在利用该菌进行棉籽饼发酵脱毒时,应注意可发酵糖类物质(如淀粉)的补充。在液体培养基中,热带假丝酵母ZD-3用于研究的适宜取种时间为12~18 h(对数生长期)。 利用热带假丝酵母ZD-3对棉籽饼进行固体发酵脱毒,通过对底物游离棉酚含量的测定,优化其发酵工艺参数。优化试验结果表明,底物组成适宜比例为棉籽饼70%、玉米粉20%、小麦麸10%。棉籽饼发酵脱毒的最佳条件参数为:发酵时间48 h,发酵温度30℃,菌液接种量5%(v/w),底物水分含量50%,自然pH值。 利用热带假丝酵母ZD-3对不同因子处理的棉籽饼底物进行生物固体发酵,然后测定发酵底物中游离棉酚(FG)、蛋白质含量等指标,探讨糖源、加热处理、尿素、硫酸亚铁、碳酸钠以及矿物质等因素对棉籽饼生物发酵脱毒效果的影响。试验结果表明,棉籽饼底物中加入不同的可发酵糖源,可显著提高脱毒效率,其中淀粉效果最好,脱毒率高达91.91%;加热处理可显著降低FG含量,有利于棉籽饼底物的发酵脱毒;但底物中添加尿素,可降低棉籽饼发酵脱毒率,不利于热带假丝酵母ZD-3发酵脱毒;底物中添加硫酸亚铁、碳酸钠和复合矿物质,可显著提高假丝酵母ZD-3对棉籽饼的发酵脱毒率,脱毒率分别高达94.70%、93.96%以及96.67%。 棉籽饼底物中分别加入0、0.5%、1%、2%的乙醇胺或氯化胆碱,混合均匀,然后进行热处理试验和微生物发酵试验。试验结果表明,棉籽饼底物中加入不同比例的乙醇胺或氯化胆碱,不利于棉籽饼热处理脱毒和发酵脱毒。 通过测定发酵底物FG含量、底物蛋白酶活性(中性、碱性和酸性)和底物菌量的方法研究氯化胆碱、乙醇胺、卵磷脂以及全脂大豆对发酵效果的影响。试验结果表明,①在底物热处理条件下发酵,氯化胆碱、乙醇胺、卵磷脂和全脂大豆均无促进发酵脱毒作用,除氯化胆碱外,均显著降低发酵脱毒效率;氯化胆碱、乙醇胺和卵磷脂可极显著提高中性蛋白酶活性;氯化胆碱和卵磷脂可极显著提高碱性蛋白酶活性;各处理因素均可极显著提高底物酸性蛋白酶活性;各处理因素可极显著提高底物菌体含量,其中氯化胆碱效果最好。②在底物非热处理条件下发酵,乙醇胺、卵磷脂和全脂大豆均无促进发酵脱毒作用,且显著降低发酵脱毒效率,但氯化胆碱有促进发酵脱毒的趋势;卵磷脂和全脂大豆可极显著提高中性蛋白酶活性;各处理因素可极显著提高底物碱性蛋白酶活性,极显著降低底物酸性蛋白酶活性;氯化胆碱可极显著提高底物菌量,而其它因素处理的底物菌量显著降低。③研究发现氯化胆碱对棉籽饼底物发酵脱毒和底物营养价值有重要的意义,其底物蛋白酶活性高、菌量多。在底物非热处理条件下发酵,低浓度氯化胆碱具有促进发酵脱毒的作用。 利用热带假丝酵母ZD-3和黑曲霉ZD-8对棉籽饼进行单菌及复合菌种发酵,然后测定发酵底物中游离棉酚(FG)、粗纤维(CF)、粗脂肪(EE)、氨基酸含量,体外法测定饲料蛋白质氨基酸消失率,用环境扫描电镜拍摄底物发酵后的显微形态结构变化等研究复合发酵效果。试验结果表明,复合发酵可极显著地降低棉籽饼底物游离棉酚含量,脱毒率为91.64%;棉籽饼底物粗蛋白、总氨基酸、必需氨基酸含量分别提高27.83%、18.15%、19.18%;提高粗蛋白、总氨基酸及必需氨基酸体外消化率分别为20.90%、26.16%、24.47%,赖氨酸和蛋氨酸分别增加20.24%、66.29%。底物CF和EE含量显著降低。环境扫描电镜图片表明,复合发酵处理棉籽饼底物后,黑曲霉形态结构发生变化,其菌丝变细,未观察到孢子头,只见光秃秃的顶囊。酵母菌形态未发现有明显变化。试验结果表明,复合发酵效果明显优于单菌发酵棉籽饼底物的效果,不但达到棉酚脱毒的目的,而且发酵饲料营养价值显著提高。复合发酵时,热带假丝酵母ZD-3对黑曲霉ZD-8的形态变化有显著影响。 利用热带假丝酵母ZD-3和黑曲霉ZD-8对不同因子处理的棉籽饼底物进行复合固体发酵,然后测定发酵底物中游离棉酚(FG)、蛋白质含量等指标探讨发酵时间、底物棉籽饼比例、碳酸钠、加热处理、硫酸亚铁以及矿物质等处理因素对棉籽饼复合发酵脱毒效果的影响。试验结果表明,复合发酵适宜时间为48h;底物适宜的组成比例为棉籽饼70%、玉米粉20%、小麦麸10%;在底物中添加0.5%~1.0%的碳酸钠可提高复合发酵脱毒率。加热处理可极显著降低FG含量,有利于棉籽饼底物的发酵脱毒;底物中添加硫酸亚铁和复合矿物质,可显著提高复合发酵脱毒率。这一结论和热带假丝酵母ZD-3发酵试验结果是一致的。


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