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基于纸片保存奶样的奶牛隐性乳腺炎诊断技术研究

吴旧生  
【摘要】: 本文从奶牛隐性乳腺炎的流行病学、影响纸片保存奶样中乳糖、乳蛋白等生化指标测定的因素、纸片保存奶样中无乳链球菌、金黄色葡萄球菌的PCR检测方法及其适用性进行了探索、最后对牛奶蛋白的SDS-PAGE电泳在隐性乳腺炎诊断的应用作了探讨,并对各种方法与标准诊断方法进行了比较分析。 对杭州等地4388份奶样体细胞计数值与季节、奶产量、泌乳周期、乳脂和脂蛋白等因素的关系进行了调查,利用限制性最大似然估计(REML)模型进行了分析,结果表明采样月份(F=8.83,p<0.01)、日奶产量(F=212.12,p<0.01)、胎次(F=16.86,p<0.01)、乳脂率(F=71.87,p<0.01)、乳蛋白(F=78.92,p<0.01)等因素对奶样体细胞数均有显著影响。利用混合线性模型的最大似然估计(REML)方法建立了体细胞计数响应模型,该模型可以有效地预测体细胞数的变化规律。在此基础上利用Logistic回归模型分析了采样月份、胎次、泌乳周期和日产奶量等因素对隐性乳腺炎发病率的影响程度,建立了相应的预测模型,经共线性检验,模型预测值与原始数据吻合良好(p>0.05)模型分析提示,每年的8-9月份体细胞水平显著升高(p<0.05)。日产奶量在20-30kg,乳脂率在3.5-5.0%,蛋白含量在2.5-3.1%时奶牛隐性乳腺炎发病机率最低。 纸片保存奶样中乳糖含量的变异系数略大于液态奶样,但乳糖水平无显著差异(t=0.389,p>0.05)。保存期(F=1.004,p>0.05)、保存温度(F=0.004,p>0.05)对纸片保存奶样的乳糖水平没有显著影响,其乳糖含量仅受奶样本身体细胞数的影响(F=162.42,p<0.01)。提示纸片保存奶样适用于进行牛奶乳糖指标的测定。 纸片保存奶样的蛋白含量约为液态奶样的83.6%,其变异系数为4.41%。保存时间和预处理介质对纸片保存奶样蛋白含量有显著影响(p<0.01),并受牛奶体细胞数的影响(p<0.05)。保存温度对其影响不显著(p=0.052)。保存时间和预处理介质对纸片保存奶样的蛋白水平有协同影响(p<0.01)。初始值和保存1、2、4周的样品间均有统计学显著差异(p<0.05);随着时间的延长,样品中蛋白含量逐渐下降,DDW、Tris盐酸缓冲液预处理对纸片保存奶样蛋白水平均有显著影响,EDTA对测定结果没有显著影响(p>0.05)。提示纸片保存奶样蛋白质含量稍有下降,但在1-4周内可以保持相对稳定。 对人工污染无乳链球菌的纸片奶样进行复苏培养,结果表明,纸片预处理介质(p<0.01)和保存期(p<0.01)对纸片保存无乳链球菌复苏率有显著影响,而保存温度对结果的影响较小(p>0.05)。纸片保存温度(p<0.05)、预处理方法(p<0.01)和保存期(p<0.01)对金黄色葡萄球菌的培养成功率有显著影响。 针对无乳链球菌16-23S rRNA基因间区序列的引物,可扩增出唯一的270bp的PCR产物,而对人工污染的金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和大肠杆菌的液态奶和纸片保存样品均无扩增产物形成。该引物对无乳链球菌的PCR检测灵敏度为2×10~2cfu/ml,与液态奶的检出结果相似。预处理方法对PCR结果没有显著影响,所有处理均可获得满意的PCR结果。以细菌培养为参照,PCR诊断的敏感性为96.15%,特异性为98.60%,准确率为98.06%,可以有效地从纸片保存样品中检出无乳链球菌。 金黄色葡萄球菌引物SAISR1和SAISR2可分别从纸片保存样品中扩增出约500bp和250bp的特异性PCR产物,而对人工污染无乳链球菌等奶牛隐性乳腺炎主要病原无特异性扩增。SAISR1和SAISR2对纸片样品的检测灵敏度分别为2×10~4CFU/mL和2×10~3CFU/mL;若采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合硝酸银染色,SAISR2的灵敏度可提高至2×10~1CFU/mL。纸片预处理介质对PCR结果没有显著影响。以细菌为标准,SAISR2的灵敏度为89.19%,特异性为98.08%,诊断准确率96.37%,可有效地从纸片保存奶样中检出金黄色葡萄球菌。 利用SDS-PAGE研究了纸片保存奶样乳蛋白成分变化,分子量较小的成分得到较好的分离(R_f>0.2),呈现为独立的条带群。分子量较大的成分滞留在上样孔附近,迁移率很小(R_f<0.2)。迁移率较大的成分主要形成R_f值在0.51(A),0.62(B),0.72(C),0.78(D),0.84(E)和0.98(F)等6个条带群,其中C、D和E三个条带群,可因奶样不同而呈现不同的亮度或缺少,经与HMT、SCC和主要病原菌分离培养等试验结果联合分析,C、D、E三个条带群与SCC(r=0.795,p<0.01)、HMT(r=0.471,p<0.01)和主要病原菌的存在(r=0.389,p<0.01)有显著相关。 与细菌分离培养对比,SDS-PAGE方法对隐性乳腺炎诊断的灵敏度为100%,特异性为55.56%,若将分离到凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)也计入病原菌,则SDS-PAGE的灵敏度为90%,特异性为70.59%,与细菌培养的结果高度一致(kappa=0.622,p<0.05),PAGE方法比常用的HMT方法具有更好的灵敏度和特异性,与SCC法相当。 综上所述,纸片保存奶样的隐性乳腺炎诊断可以采用乳糖、蛋白成分分析和PCR检测等方法进行,其中以PCR方法的特异性较高,而以蛋白质成分分析的灵敏度最高。


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