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7-氨基头孢烷酸酶法生产的研究

郑华宝  
【摘要】: D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase,DAAO)和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶(Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase,GLA)是两步酶法制备7-氨基头孢烷酸的重要工业用酶,头孢菌素C(Cephalosporin C,CPC)经DAAO催化氧化脱羧反应生成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA),再在GLA作用下,水解生成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。 本学位论文围绕两酶法生产7-ACA进行了以下方面的研究。 1.以携带6个组氨酸(6*His)的DAAO(HDAAO)编码序列构建三株整合型巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)基因工程菌。在三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(GAP)控制下胞内表达HDAAO的MMZY03,以及醇氧化酶启动子(Alcohol Oxidase,AOX1)启动子控制下分泌表达菌株MMZY02和胞内表达菌株MMZY01。诱导型重组菌株发酵培养基选用基本盐培养基,组成型重组菌株发酵培养基选用YPD培养基。三种重组菌株在5L自控罐的发酵实验显示,MMZY03发酵13h的产酶达到7293 U/L。而据报道的AOX1控制下表达量达到最高需要43h。然而不论是AOX1的诱导分泌型表达(MMZY01),还是GAP启动子的组成型分泌表达(MMWY01)产酶活力均不高,并不能满足实际应用的需要。 2.组成型胞内表达HDAAO的重组P.pastoris MMZY03发酵后收获的含DAAO细胞经过压榨破壁,无细胞提取液经二价金属螯合亲和层析纯化,进一步以Amberzyme~(TM)环氧版树脂为载体,制得的HDAAO固定化酶活力为75U/g(湿载体)。该固定化酶连续用于CPC的酶促转化反应14批次,HDAAO的表观活力并无明显下降。因此,所构建的组成型胞内表达HDAAO的重组P.pastorisMMZY03以及HDAAO固定化酶制备工艺具有潜在的产业化应用前景。 3.D-氨基酸氧化酶属于黄素蛋白酶。增加酶反应系统的内部气压或通入纯氧气来提高反应液中的溶解氧浓度将有助于提高DAAO催化效率。据报道,在氧气缺乏的环境下,来源于透明颤菌的血红蛋白(VHb)能提高异源宿主细胞的生长量。红酵母来源(Rodotorula gracilis)的DAAO与VHb融合表达,融合蛋白制备的固定化酶提高了对CPC的转化效率。我们推测在体外VHb能起到氧载体作用。本工作分别构建了表达VHb,三角酵母DAAO和VHb融合表达的蛋白。分别添加1.0 mg游离态VHb或300 mg固定化VHb,固定化D-氨基酸氧化酶催化头孢菌素C的比活力与对照相比分别提高了3倍和2倍。将三角酵母DAAO和VHb融合表达,制备的固定化酶活力要高于没有融合的DAAO。 4.在GL-7-ACA酰化酶的一步纯化并固定化的研究中,构建了酰化酶N端组氨酸标签位置和长度均不等的四种重组质粒,即pET28GA01,pET28GA02,pET24GA01,pET24GA02。这些重组质粒在E.coli BL21(DE3),宿主细胞中发酵表达,证明BL21(DE3)/pET28GA01的发酵单位最高,达到3800 U/L。BL21(DE3)/pET28GA02发酵单位是2184 U/L。BL21(DE3)/pET24GA01和BL21(DE3)/pET24GA02发酵单位分别是2092U/L和754U/L。经对固定化载体的优选确定以FP-IDA-Ni~(2+)树脂分别对等量的4种GLA进行一步纯化,固定化结果表明固定化酶表观活力在66.7到80 U/g之间,差别不大,其中以28GA01催化剂转化反应21批次,7-ACA转化收率约是90%,未发现GLA活力下降。 本学位论文研究初步结果为D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶在两步酶法制备7-ACA中实际应用提供了基本数据。


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