收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

哈维氏弧菌外膜蛋白(OmpK和GAPDH)免疫原性研究及主要海水病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选

张崇文  
【摘要】: 海洋弧菌是海水环境中普遍存在的一种革兰氏阴性细菌,其中某些种类是大黄鱼等海水养殖动物细菌性溃疡病的主要病原菌。鉴于滥用抗生素所造成的药物残留、细菌耐药性等不良后果,大黄鱼弧菌病的防治不得不从以化学药物治疗为主转向免疫预防。近年来,革兰氏阴性细菌外膜蛋白作为潜在的保护性抗原已越来越引起人们的重视。本研究从患病大黄鱼上分离得到三种常见病原菌:哈维氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌,以哈维氏弧菌为主,克隆并表达了两个外膜蛋白基因,研究了它们作为亚单位疫苗的免疫原性。利用免疫蛋白质组学方法结合基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,鉴定了三种弧菌具有交叉免疫反应性的外膜蛋白成分,探索开发基因工程多价疫苗的可能性。 哈维氏弧菌ompK基因含有一个804bp的开放读码框(ORF),编码由267个氨基酸组成的外膜蛋白OmpK,预测的分子量约为29KDa,pI为6.764。序列测定结果用BLAST软件搜索比对,和已登录的哈维氏弧菌外膜蛋白基因ompK的同源性高达99%,该基因在GenBank登录号为DQ279075;哈维氏弧菌gapdh基因含有一个996bp的开放读码框(ORF),编码由331个氨基酸组成的三磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH,预测的分子量约为35KDa,pI为5.187。BLAST软件搜索比对发现多种不同弧菌的gapdh是高度保守的,它们的核苷酸同源性在91%以上。该基因在GenBank登录号为DQ184650。 用LipoP软件分析可知ompK基因N端存在一个由20个氨基酸组成的信号肽,但gapdh基因没有发现信号肽序列,其到达细胞外膜的机制尚不明确。将ompK基因的信号肽序列去除经重叠延伸基因拼接扩增(SOE-PCR)和gapdh基因融合成ompK-gapdh,分别构建原核表达载体pET-30a-ompK,pET-30a-gapdh和pET-30a-ompK-gapdh,在E.coliBL21中成功大量表达。重组OmpK和GAPDH经Ni-NTA亲和层析柱纯化后免疫新西兰兔,产生的多克隆抗体不仅能够分别跟各自的免疫原发生免疫反应,而且能够和提取的天然外膜蛋白产生免疫印迹,表明重组蛋白和天然外膜蛋白具有相似的免疫原性。新鲜培养的哈维氏弧菌能够分别被兔抗r-OmpK和兔抗r-GAPDH抗血清凝集,证明OmpK和GAPDH位于细胞表面。 根据同源建模原理模拟了哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK、GAPDH的三维结构。外膜蛋白OmpK是由12个反向平行的β折叠经6个表面环和5个外周回折连成的桶状结构,以单体形式穿过细胞外膜形成通道;三磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH只是两个结构域经一短链连接而成,每个结构域各包含9个反向平行的β折叠和6个α螺旋。提取自哈维氏弧菌的天然外膜蛋白沸水浴中加热一段时间后经SDS-PAGE,分别和兔抗r-OmpK和兔抗r-GAPDH抗血清反应。由于加热使得孔蛋白的构像发生改变,包括β桶状二级结构的丧失等,兔抗r-OmpK血清反应中出现了两条反应带,表明OmpK类似于OmpA家族,具有热修饰性。而兔抗r-GAPDH血清只出现一条带,说明GAPDH无热修饰性。 将r-OmpK-GAPDH,r-OmpK,r-GAPDH及二者的混合物分别免疫大黄鱼,采集血清,ELISA检测抗体效价,尽管免疫组和对照组差别显著(p<0.05),但抗体效价不是很高,表明体液免疫在外膜蛋白引起的抗病过程中作用有限。分离试验大黄鱼的巨噬细胞,测定其对啤酒酵母的吞噬百分率和吞噬指数。统计结果表明巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数不仅免疫组和对照组差别显著(p<0.05),免疫组内r-OmpK-GAPDH和其他各组的差异也很明显(p<0.05),意味着细胞免疫在外膜蛋白的免疫保护中具有重要作用。各试验组大黄鱼用500×LD_(50)的哈维氏弧菌感染,各免疫组的相对成活率r-OmpK(37.7%),r-GAPDH(40.0%)及二者的混合物(41.9%),r-OmpK-GAPDH(69.1%)都显著高于对照组,其中r-OmpK-GAPDH(69.1%)最高,说明OmpK和GAPDH具有一定的免疫原性,二者融合后显示出明显的协同作用,可以作为亚单位疫苗的候选成分。 从患病大黄鱼中分离的8株病菌,经常规生理生化方法和以HSP60基因部分序列为基础的分子生物学方法鉴定为三种病原弧菌:哈维氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌。SDS-PAGE和Western-blots结果显示三种弧菌的外膜蛋白和哈维氏弧菌全菌多抗反应分别在45kDa,35kDa和22 kDa处出现三条大致相同的免疫条带,提示它们有可能是三种弧菌的交叉保护性抗原。利用免疫蛋白质组学方法结合基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,鉴定出哈维氏弧菌与副溶血弧菌和溶藻弧菌具有交叉反应性的部分外膜蛋白分别是副溶血弧菌麦芽糖孔蛋白和溶藻弧菌的一种功能未知的孔蛋白。以这些蛋白为目标抗原制备基因工程疫苗,可望能够同时抵抗不同种弧菌的感染,在基因工程多价疫苗的开发方面具有重要意义。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 刘振兴;;鱼类弧菌疫苗的开发与利用现状(上)[J];渔业致富指南;2009年21期
2 田丁;林天龙;许斌福;;创伤弧菌、溶藻弧菌外膜蛋白特性的比较研究[J];水产科学;2011年01期
3 张伟妮;周丽;邢婧;战文斌;;大菱鲆致病性溶藻弧菌SR1的外膜蛋白及其抗原性分析[J];中国水产科学;2007年03期
4 覃映雪;王军;王世锋;鄢庆枇;;哈维氏弧菌TS-628菌株抗原性研究[J];厦门大学学报(自然科学版);2006年03期
5 黄志坚;何建国;;溶藻弧菌菌体及其外膜蛋白多克隆抗体的研究[J];中山大学学报(自然科学版);2006年03期
6 刘湛军;梁海鹰;吴灶和;简纪常;;2种弧菌鞭毛蛋白的分离纯化与鉴定[J];吉首大学学报(自然科学版);2008年06期
7 洪婧妮;毛勇;苏永全;王军;;哈维氏弧菌和溶藻弧菌对大黄鱼6种酶活性的影响[J];厦门大学学报(自然科学版);2009年03期
8 黄志坚;何建国;;溶藻弧菌外膜蛋白(Va-OMP)的免疫原性及免疫保护性[J];水产学报;2006年04期
9 黄志坚;何建国;;应用噬菌体随机肽库研究抗溶藻弧菌及其外膜蛋白单抗识别的特异性表位[J];中山大学学报(自然科学版);2006年05期
10 许斌福;林能锋;俞伏松;林天龙;;大黄鱼溶藻弧菌外膜蛋白ISCOMs的免疫效果初步研究[J];福建农业学报;2008年03期
11 盖春蕾;李健;刘淇;王群;;二氟沙星对3种海洋弧菌的抗菌后效应研究[J];海洋水产研究;2008年02期
12 李明云;丁文超;陈炯;史雨红;;溶藻弧菌外膜蛋白OmpK基因表达和间接ELISA检测方法的初步建立[J];水产学报;2010年10期
13 姚雪梅,王珺,王思,周平;人工培养牟氏角毛藻对弧菌抑制效果研究[J];南方水产;2005年04期
14 李华;石存斌;钱永华;潘厚军;吴淑勤;;哈氏弧菌外膜蛋白与溶藻弧菌脂多糖偶联疫苗的效果研究[J];中国水产科学;2007年06期
15 陈晓凤;常建波;蔡道财;;牙鲆“体表出血病”病原的研究[J];集美大学学报(自然科学版);2008年01期
16 丁文超;胡健饶;史雨红;李明云;陈炯;;环介导恒温扩增技术快速检测溶藻弧菌[J];分子细胞生物学报;2009年01期
17 庞欢瑛;吴灶和;简纪常;鲁义善;;温度对溶藻弧菌HY9901株致病性相关蛋白的调控[J];水生生物学报;2008年06期
18 张晓华,徐怀恕,PeterRobertson,BrianAustin;副溶血弧菌的外膜蛋白及其抗原性研究[J];中国水产科学;1997年04期
19 董传甫,林天龙,许斌福,龚晖,林能锋;电泳和免疫印迹分析副溶血弧菌和溶藻弧菌主要外膜蛋白和多糖抗原[J];中国人兽共患病杂志;2004年07期
20 ;科技动态[J];中国水产;2007年10期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王秀英;吴灶和;简纪常;鲁义善;;溶藻弧菌外膜蛋白W基因及克隆表达[A];2008年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2008年
2 徐常新;王三英;彭宣宪;;对不同Na~+浓度条件下溶藻弧菌外膜蛋白的蛋白质组学分析[A];中国细胞生物学学会医学细胞生物学、免疫细胞生物学和发育生物学专业委员会学术研讨会论文摘要汇编[C];2002年
3 成进;谷文喜;李文蓉;沙依然古丽;依米提;;鸡伤寒白痢沙门氏菌外膜蛋白油乳剂疫苗的研制[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年
4 刘燕;韦强;鲍国连;季权安;;不同血清型鸭疫里默杆菌外膜蛋白免疫原性分析[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年
5 朱德康;程安春;汪铭书;;五种血清型的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白特性比较及其免疫原性的研究[A];中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第七次学术研讨会论文集[C];2004年
6 徐敏;王静;薛斐;牟海津;;海洋细菌细胞脂肪酸组成的研究[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
7 丁伯良;鄢明华;王英珍;李秀丽;黄金海;白朋勋;王东;张健;赵向华;;鸡大肠杆菌异型外膜蛋白原生质体融合菌株的构建[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(下)[C];2003年
8 林向民;张丹风;吴丽娜;王三英;彭宣宪;;大肠杆菌K-12外膜亚蛋白质组学研究[A];中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集[C];2005年
9 彭宣宪;;细菌外膜功能蛋白质组学研究[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年
10 范泉水;邱薇;孙阳;李刚山;杨美峰;尹惠琼;李丽红;;犬型钩端螺旋体外膜蛋白基因的克隆及其表达研究[A];第十三次全国养犬学术研讨会论文集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张崇文;哈维氏弧菌外膜蛋白(OmpK和GAPDH)免疫原性研究及主要海水病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选[D];浙江大学;2007年
2 毛芝娟;副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus主要外膜蛋白的克隆、表达和免疫原性研究[D];浙江大学;2007年
3 白方方;哈维氏弧菌VHH溶血素对牙鲆组织细胞的侵染作用及诱导细胞凋亡作用研究[D];中国海洋大学;2010年
4 贾爱荣;大菱鲆4种免疫相关基因的克隆、表达分析及溶藻弧菌溶血素的研究[D];中国海洋大学;2010年
5 孙铂光;哈维氏弧菌VHH溶血素作用机理的研究[D];中国海洋大学;2009年
6 刘瑞;副溶血弧菌丝氨酸蛋白酶及溶血素的表达、纯化、定点突变及弧菌多联DNA疫苗的研制[D];中国海洋大学;2011年
7 陈万义;副溶血弧菌高通量分子检测方法的建立与基因分型研究[D];上海交通大学;2011年
8 钱荣华;溶藻弧菌主要毒力相关基因的克隆、表达及其免疫原性研究[D];浙江大学;2007年
9 芮浩鹏;从鱼到人:主要病原性弧菌的致病机理研究[D];华东理工大学;2011年
10 祝儒刚;海产品中致病性副溶血弧菌PCR快速检测体系建立及定量研究[D];沈阳农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李萍;副溶血弧菌对西施舌致病性及其外膜蛋白的研究[D];福建农林大学;2009年
2 李华;哈氏弧菌和溶藻弧菌亚单位偶联疫苗的初步研究[D];西北农林科技大学;2007年
3 赵明君;海洋弧菌复苏促进因子家族糖蛋白酶的研究[D];中国海洋大学;2011年
4 何超军;哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的原核和真核表达[D];华中农业大学;2011年
5 刘洪明;水产动物主要病原细菌免疫特性的比较研究[D];中国海洋大学;2003年
6 顾宏伟;兔多杀性巴氏杆菌铁调节外膜蛋白的免疫原性、表位及耐药性的分析[D];南京农业大学;2004年
7 徐瑾;临床分离志贺菌属细菌膜耐药机制的研究[D];郑州大学;2005年
8 陈雅芳;哈维氏弧菌胞外产物及鞭毛蛋白的研究[D];厦门大学;2006年
9 王斌;甲型副伤寒沙门氏菌CMCC 50973外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2006年
10 庞观宏;湛江港网箱养殖海域环境因子与细菌数量的调查及弧菌属细菌的分布[D];广东海洋大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 张元跃;南宁海产品副溶血弧菌检出率高达71.4%[N];中国食品质量报;2006年
2 高晶霞记者 吴天飞;市卫生监督部门发布食品安全预警[N];哈尔滨日报;2007年
3 本报记者 周丽;如何安全应对腹泻[N];河北日报;2006年
4 林岳夫;我国研制出多联鱼病防治疫苗[N];中国海洋报;2004年
5 ;海鲜中毒进入“高发期”[N];人民日报;2006年
6 林岳夫;福建制成多联鱼病防治疫苗[N];农资导报;2004年
7 麦文伟;湛江局两项地方标准国内领先[N];中国国门时报;2007年
8 本报记者 王威克;2008年水科院十大成果亮点[N];中国渔业报;2009年
9 乔家峰;水科院审议通过2007年度院科技进步奖[N];中国渔业报;2008年
10 韩振奎;腹泻原因各不同胡乱止泻恶果生[N];中国石化报;2004年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978