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脑钠肽对心肌重塑的作用机制研究

王天楠  
【摘要】: 心力衰竭(Heart Failure)是一种大多数心血管疾病发展的共同终末阶段,包括心肌梗死、高血压、心律失常和糖尿病等危险因素均参与其中。由于医学的快速发展,随着大多数心脏病有效治疗措施的不断进步和人口的老龄化,心力衰竭的患病率也逐年升高,目前死亡率已经与一些常见的恶性肿瘤相当,而且心力衰竭的患者一旦出现症状,其五年生存率不足50%,成为目前入院率最高的疾病和治疗的难点。心力衰竭在某种程度上不单单是心排量的下降和静脉淤血,而是一系列临床征候群,会形成恶性循环和进行性发展。随着分子细胞生物学的发展,目前公认心肌重塑是心力衰竭病理发展过程中的基本机制和前兆,因而国际上提出阻断心肌重塑的恶性循环是治疗慢性心力衰竭的关键。 心肌重塑包括心肌肥厚和心肌细胞凋亡两大主要事件,其中心肌肥厚能够代偿心脏压力负荷和容量负荷的增加,而心肌细胞凋亡或坏死则加速心衰的恶变,两者已成为进行性心衰的基本病理过程和决定心力衰竭演变的重要病理因素。除了神经体液因素以外,低氧压力是广泛参与缺血性心脏病和心功能失调等心脏疾病后心肌重塑的主要诱导因子。大量的研究证明,低氧不仅促进心肌缺血后围缺血区的心肌细胞病理性代偿肥大,而且具有潜在诱发存活心肌细胞凋亡的作用。 近年来人们发现,在心力衰竭、心肌梗死等心脏疾病或心脏负荷增加的早期,患者血浆中一种主要由心室分泌的多肽类神经内分泌激素—脑钠肽(Brainnatriuretic peptide,B-type natriuretic peptide,BNP)的水平明显升高,可以作为临床诊断上述疾病并诊断和预测预后的可靠标记物。大量研究证实,心肌细胞膜上存在着BNP的受体,BNP通过心肌细胞上的尿钠肽受体,激活鸟苷酸环化酶(Guanylyl cyclase,GC)产生大量环磷酸鸟苷(3′,5′-cyclic monophosphate,cGMP)参与细胞内的下游信号级联放大通路。因此随着对BNP研究的快速深入,2001年美国Scios公司研发的重组人工合成BNP已经成为FDA批准治疗急性失代偿性心力衰竭的临床一线用药——奈西立肽(hBNP、Nesiritide、Natrecor)。但至今为止BNP作为长期治疗慢性心衰的临床用药,其疗效和预后还很不明确,尤其对心肌重塑中的细胞凋亡和肥厚的作用机制国内外鲜有报道。基于以上研究背景,本研究旨在:建立慢性低氧条件下诱导心肌细胞肥大和心肌细胞凋亡的体外病理模型,系统研究外源性BNP对心肌肥厚和心肌细胞凋亡的作用,力图阐明BNP对心肌重塑的细胞分子水平作用机制,为其应用于临床慢性心衰的长期治疗提供基础研究依据。本研究包括以下内容: Ⅰ.首先建立心肌细胞肥大的模型,采用Bradford法、[~3H]-亮氨酸摄取实验以及细胞表面积统计验证心肌肥大模型的可靠性与稳定性。在此基础上进一步探讨BNP对肥大心肌细胞的作用机制。综合运用了全波长酶标仪、激光共聚焦显微镜、液体闪烁仪等仪器,采用RIA方法、Greiss法和Bradford法等研究并证实:BNP剂量依赖性地抑制心肌细胞的肥大,同时增加慢性低氧条件下肥大细胞内cGMP和亚硝酸盐的产量。正常心肌细胞表达三种一氧化氮合成酶,在亚硝酸盐产量-时间曲线上,我们证实12h低氧条件下,特异性诱导型一氧化氮合成酶(induced-Nitric Oxide Synthase,iNOS)是参与本研究NO合成的主要酶,而内皮性一氧化氮合成酶(endothelial-Nitric Oxide Synthase,eNOS)只与低氧早期NO的产生有关,对晚期并没有明显的影响。进一步的实验还证明,BNP增强了低氧条件下心肌细胞内iNOS的酶活性,而对eNOS的酶活性没有作用。另外,本研究运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT PCR)扩增技术发现,BNP增强低氧诱导的iNOS mRNA表达既而增强iNOS活性和亚硝酸盐含量。而且研究还发现,cGMP类似物—8-bromo-cGMP(8-bromo-guanosine 3′,5′-monophosphate)也具有BNP类似的作用,而AG和cGMP依赖性蛋白激酶阻断剂——Rp-8-br-cGMP能够抑制BNP的作用。由于NO是目前公认抑制心肌肥厚的内源性调节因子之一,因而本研究提示,BNP对低氧诱导心肌细胞肥大的抑制作用基本上是通过尿钠肽受体后细胞激活内cGMP的合成,上调iNOSmRNA的表达,提高iNOS酶活性而产生大量NO,从而抑制心肌细胞的肥大。 Ⅱ.其次建立了心肌细胞凋亡的病理模型,通过凋亡特异性染色实验来验证心肌细胞凋亡模型的可靠性与稳定性,在此基础上运用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观测凋亡早期细胞膜磷脂酰丝氨酸的改变和线粒体膜电位改变、用全波长酶标仪检测caspase-3(cysteine-requiring aspartate protease-3)的酶活性。结果证实,BNP增强低氧诱导线粒体跨膜电位丧失、促进磷脂酰丝氨酸外翻及增强caspase-3酶活性等凋亡相关事件。此外运用Real-time RT PCR技术发现,BNP进一步降低慢性低氧条件下线粒体外膜上Bcl-2 mRNA的表达。8-bromo-cGMP具有和BNP相似的作用,而Rp-8-br-cGMP能够抑制上述BNP和8-bromo-cGMP的作用。 综上所述,本研究的主要发现和结论是:(1)BNP通过受体后激活GC,增加细胞内cGMP的含量,上调iNOS mRNA的表达、增强iNOS的活性和NO的产生,进而抑制了慢性低氧诱导的心肌细胞肥大;(2)BNP通过受体后激活GC,上调细胞内cGMP的含量,激活细胞内线粒体相关凋亡通路,增强慢性低氧诱导的细胞凋亡。本研究从心肌重塑的两种基本病理事件入手,观察到BNP对心肌重塑具有负性调节作用,为BNP应用于临床的长期治疗提供基础研究依据。 总之,我们系统研究了BNP对心肌重塑的细胞及分子作用机制,提出不同水平的慢性低氧是心肌重塑的独立诱导因子。并进一步观察到BNP具有抑制慢性低氧诱导的心肌肥厚,促进心肌细胞凋亡的负性调节作用,从而提示BNP用于长期治疗心脏疾病还有待商榷。


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