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固液废弃物资源化功能微生物制剂研发及外源固氮菌与土壤特性关系研究

朱日清  
【摘要】: 微生物制剂广泛应用于禽畜粪高温堆肥及农业生产,以促进堆肥腐熟、增加作物养分供应或增强作物抗病性,对保护农业生态环境和农业增产增收具有重要作用。然而,由于生产和使用成本过高以及接种效应的不稳定限制了农用微生物制剂的推广应用。另一方面,大量高浓度食品工业有机废液,如谷氨酸发酵液经提取谷氨酸后剩下的味精废液,具有低pH、高COD和BOD、高SO_4~(2-)、高菌体含量和排放量大的特点,导致治污达标困难,带来巨大环境污染治理压力。其含有的大量N、P、K营养和多种微量元素能为微生物和植物生长提供丰富优质的营养源。因此,将味精废液等食品工业有机废水作为微生物制剂和基质栽培营养液的营养源开发利用,可以减轻其环境污染治理压力,实现其营养资源的再循环利用,并降低微生物制剂和基质栽培的生产成本。为此,本文在分离、筛选获得高效功能微生物菌株的基础上,以高浓度食品工业有机废水为营养源,研究了畜禽粪廉价发酵菌剂和联合固氮菌接种剂等农用微生物制剂的培养基配方和应用效果;研究探讨了改性味精废液作为番茄基质培营养液的可行性;针对微生物制剂接种效果的不稳定性问题,着重探讨了外源固氮菌接种效果与土壤因子的相互关系。取得主要结果如下: (1)从市售发酵有机肥、鸡粪及菜园土壤等分离源,利用细菌、霉菌、真菌、放线菌和酵母菌选择性培养基,分别在30℃、45℃培养温度下,共分离获得了10个纤维素降解功能候选分离物;利用霉菌、放线菌、酵母菌和羧甲基纤维素钠培养基,分别在30℃、45℃和70℃培养温度下,共分离获得9个除臭功能候选分离物。进一步通过纤维素降解能力、除臭能力和植物病原真菌抗性测定,从15株自行分离或实验室收藏的菌株中筛选出地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、浸麻芽孢杆菌、新木和里氏木霉等8株具有或兼具降解纤维素、除臭和抗病等多重功能的微生物作为高温堆肥发酵菌剂开发的候选菌株。 (2)通过味精废液、黄泔水和蔗糖3因子3水平L_9(3~4)正交设计试验,筛选出8个供试畜禽粪发酵候选菌株的3种营养源基础培养基配方;并通过12种营养元素的L_(16)(2~(15))正交设计试验,在上述3种营养源基础培养基配方的基础上筛选出各候选菌株添加常量和微量元素的优化配方。结果表明,利用味精废液、黄泔水等食品工业有机废水作为功能菌的基本营养来源,并适量添加常量和微量元素来生产廉价微生物菌剂是可行的。培养基配方申请国家发明专利(申请号:200510049704.9),已通过初审进入实审。 (3)通过鸡粪高温堆肥发酵试验,研究了自行制备的廉价发酵菌剂的高温堆肥效果。秋季堆肥试验结果表明,5个单一功能菌剂及它们的2个复合菌制剂接种处理,相对于不接种对照,加速肥堆升温效果显著,其中地衣芽孢杆菌、浸麻芽孢杆菌及混合菌剂2的升温作用更为明显。冬季堆肥试验,以2个市售发酵菌剂和不接种空白处理为对照,比较了接种9个单一菌剂及它们复合菌剂的堆肥升温效果,筛选出肥堆升温和促腐效果达到或超过酵素菌的菌株6个:地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、浸麻芽孢杆菌、里氏木霉、CMC-W70-S、CS-R30-P。春季堆肥试验结果表明,采用6个菌株制备的混合菌剂接种处理的肥堆升温、保氮、pH和有机肥全氮磷钾含量及有机质含量达到或超过市售发酵菌剂的接种效果,表明本研究开发的利用有机废液生产的发酵菌剂在禽畜粪高温堆肥中具有实际应用价值。 (4)通过番茄基质培盆栽试验、大棚滴灌试验和西瓜田间试验,研究了改性味精废液作为番茄基质栽培营养液的可行性以及采用有机废液制备的联合固氮菌W12和地衣芽孢杆菌等微生物制剂对西瓜、番茄的接种效应。①番茄基质培盆栽试验结果表明,浇施味精废液处理可显著增加番茄株高、叶片数和茎粗,促进其营养生长,并使番茄提早开花,有利于生殖生长,尽管始花期恰逢连阴雨天气影响初期花的挂果,但产量仍略高于完全营养液处理。而且,栽培基质的电导率与浇施完全营养液处理无显著差异。②味精废液与W12菌剂联用促生效果基质培盆栽试验结果表明,番茄茎、叶的全氮量表现为接种W12处理极显著高于不接菌对照,浇味精废液处理极显著高于其它两个营养液,且番茄茎全氮含量在基质接种方式与不同营养液间的交互作用极显著,说明浇施味精废液不仅可直接为番茄植株提供营养,还可以为W12提供丰富的营养源。浇施味精废液的番茄产量显著高于完全营养液处理,而且生长后期的下位叶黄化程度明显比后者减轻。虽然浇施味精废液的栽培基质pH略低于完全营养液处理,基质的电导率略高于后者,但均在番茄生长安全pH和电导率范围内。③樱桃番茄基质培大棚滴灌味精废液试验结果,进一步证实了味精废液能改善番茄叶片的氮素营养,显著提高其叶绿素和类胡萝卜素含量。滴灌味精废液的番茄功能叶抗衰老相关因子SOD、MDA、POD和常规营养液无显著差异,却显著提高叶片可溶性蛋白含量,说明有利于提高番茄叶片的抗逆性。滴灌味精废液不仅取得与滴灌常规无机营养液相同的产量,而且果实总氨基酸增加30%,总糖度及糖酸比显著提高,总酸度明显降低,明显改善番茄果实的鲜食风味和营养品质。此外,微生物菌剂对西瓜接种田间试验结果表明,接种采用味精废液制备的地衣芽孢杆菌菌剂能使西瓜产量有所提高。综上所述,经过改性的味精废液可以作为基质培番茄营养液,且能与联合使用的功能微生物菌剂产生显著的正交互作用,提高功能微生物接种效果。该项技术已获国家发明专利授权(ZL200510049612.0)。 (5)为探讨土壤化学和生物学性状与外源固氮菌对土著菌竞争力的关系,采用联合固氮菌W12的利福平诱导抗性菌株W12-R,设计了W12-R在3个熟化度和肥力水平差异悬殊的土壤浸提液中与土著菌的竞争生长试验。结果表明,W12-R在3个土壤浸提液中单独培养时生长量无显著差异,但与土著菌共培养时,W12-R的生长受到了不同程度的抑制,其中以在有效养分含量最低的洪合土壤浸提液中受到的竞争抑制最大。补充适量碳源可不同程度削弱这种抑制,其中在洪合土壤浸提液中最为突出,使W12-R生长量回复到纯培养水平。比较在无氮培养基中W12单独以及分别与各供试土壤土著菌共培养系统中测得的固氮酶活性,发现共培养系统的固氮酶活性相对于纯培养系统大幅下降,而且三个土壤的共培养体系的固氮酶活性差异极显著(p=0.0001),其中以总氮、有机质、微生物量最高的新埭土壤共培养系统最低,而各项土壤特性指标相对较低的洪合土壤共培养系统最高。可见,外源固氮菌W12与土著菌共存时,土著微生物不仅对其生长造成营养竞争抑制,对其固氮酶活性也产生了显著的影响。进一步分析土壤NH_4~+-N含量、微生物量碳、微生物量氮、TOC以及土著细菌、真菌和放线菌数量与共培养系统固氮酶活性的关系,结果表明土壤NH_4~+-N含量和土著微生物数量越高,W12与土著菌共培养系统的固氮酶活性降低越多。由上述结果可见,对微生物量较少,肥力较低,特别是NH_4~+-N含量较低的土壤接种外源固氮菌W12,并利用固、液有机废弃物补充适当的营养源,将有利于提高其接种效果。 (6)多元统计分析结果表明,土壤土著菌固氮酶活性NAS仅与13项土壤性状指标中的土壤有效态Cd呈显著偏负相关;外源菌W12与土著菌共培养系统的固氮酶活性NA(S+W12)及W12接种效应估计值NAD(NA(S+W12)-NAS)分别与土壤NH_4~+-N、有效态Cr含量呈显著的负偏相关和正偏相关;NA(S+W12)与NAS呈显著的正相关,而NAD却与NAS呈显著的负相关,表明接种W12后共培养系统的总固氮量有一部分是来自土著固氮菌的贡献,但较高NAS却不利于提高外源固氮菌W12的接种效应。通过系统聚类分析将27个供试土样分为外源固氮菌W12接种效应明显不同的3个类型,其中,第一类由于接种效应正相关因子土壤有效Cr水平较高,而负相关因子NH_4~+-N、NAS居中等水平,因而表现为正种效应;第二类因土壤有效态Cd过高,表现为负接种效应;第三类可能由于NAS过高而具有负接种效应。根据外源固氮菌W12接种效应估计值NAD与其正相关因子土壤有效态Cr含量及负相关因子土壤NH_4~+-N含量的关系曲线,初步发现在供试土壤范围内,两者对外源固氮菌W12接种效应产生胁迫的临界值分别为2μg kg~(-1)和20mg kg~(-1),即土壤有效态Cr含量低于2μg kg~(-1)和/或土壤NH_4~+-N含量高于20mg kg~(-1)将抑制外源固氮菌W12的接种效应发挥。


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