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家蚕核型多角体病毒ORF67等基因分析

葛均青  
【摘要】: 杆状病毒是节肢动物,特别是鳞翅目昆虫重要的病原微生物。到目前为止,已有42种杆状病毒,包括33种核型多角体病毒和9种颗粒体病毒的基因组全序列被测定。对基因组全序列分析发现,仅有30个基因在所有已经测序的杆状病毒中都存在,称为杆状病毒的核心基因;而在鳞翅目杆状病毒中,有62个基因是保守存在的。 家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是杆状病毒的模式病毒之一;本研究选择了orf67、p33两个杆状病毒核心基因和p26、orf122两个鳞翅目杆状病毒保守基因为研究对象,从基因的转录、表达、亚细胞定位、病毒结构定位、基因缺失等方面,研究基因的基本特性及其功能,从而为丰富杆状病毒分子生物学提供理论基础。 本研究主要结论如下: 1.BmNPV orf67(Bm67)基因分析 Bm67位于BmNPV(T3株)基因组61190-61892nt,读码框全长705bp,编码234个氨基酸,预测分子量约为27.0kDa。在Bm67起始密码子ATG上游57nt处有一杆状病毒晚期转录基序ATAAG。用RT-PCR分析了Bm67的转录时相,结果表明,Bm67在6h p.i.开始转录。利用大肠杆菌表达系统融合表达了Bm67蛋白,并用其制备了多克隆抗血清。利用此抗血清进行Bm67表达时相的Western blot分析,发现Bm67表达产物在12h p.i.被检测出来。以上试验结果表明,Bm67是一个杆状病毒晚期表达基因。免疫荧光定位分析表明,Bm67的表达产物在细胞核和细胞质中都有分布。 为了进一步研究Bm67在病毒侵染循环中的作用,利用ET重组系统成功构建了Bm67的缺失病毒,进而利用Bac-to-Bac系统构建了一个在多角体位点重新补回Bm67的补回病毒。研究发现,Bm67缺失病毒不能生成有感染力的病毒粒子,而补回病毒能够弥补这一缺陷,BV的滴度能够达到野生病毒的水平。定量PCR分析表明,Bm67是侵染早期合成正常数量的病毒DNA所必需的。透射电镜分析表明,Bm67的缺失降低了病毒核衣壳的装配,影响了囊膜的形成,在双层核膜中间发现了囊膜装配错误的核衣壳。这些结果表明Bm67是形成有感染力的BV所必需的,且与核衣壳的装配及囊膜的的形成等过程有关。 2.BmNPV p33(p33)基因分析 P33位于BmNPV(T3株)基因组70487-71264nt,读码框全长780bp,编码一个长259个氨基酸残基的蛋白,预测分子量为30.9kDa。在p33起始密码子ATG上游184-18Int,153-150nt和125-122nt处有三个杆状病毒晚期转录基序TAAG。RT-PCR分析表明,p33在12h p.i.开始转录。利用大肠杆菌表达系统表达了GST-p33融合蛋白并利用该蛋白制备了多克隆抗血清。利用此抗血清进行p33的表达时相分析发现,p33的表达产物在18h p.i.被检测出来。以上试验结果表明,p33是一个杆状病毒晚期表达基因。利用Bac-to-Bac表达系统成功将p33与egfp在BmN细胞中进行了融合表达;结果表明,p33没有较大的翻译后修饰,在48h p.i.,EGFP-p33主要定位在细胞质内,并呈指环形点团状分布;免疫荧光定位进一步验证了上述试验结果。利用抗p33的特异性抗体,对提取纯化的BVs和ODVs进行了western blot分析,但均没有检测到特异性的条带,表明p33不是病毒的结构蛋白。 3.BmNPV p26(p26)基因分析 P26位于BmNPV(T3株)基因组107702-108422nt,读码框全长723bp,编码一个长240个氨基酸残基的蛋白,预测分子量为27.3kDa。在p26起始密码子ATG上游21-24nt处有1个TATA box。P26 mRNAs在3h p.i.就可以检测到,一直持续到96h p.i.。利用大肠杆菌表达系统表达了融合蛋白His-p26,利用其制备了多克隆抗体。利用此抗体对p26的表达时相进行了分析,在18h p.i.才可以检测到p26的表达,这可能与在病毒侵染早期p26的表达量较低有关。利用Bac-to-Bac表达系统将p26与egfp在BmN细胞中进行了融合表达,结果显示p26在细胞核和细胞质中都有分布,且在细胞核中聚集成团状;免疫荧光定位表明p26主要分布在细胞质内,这可能是因为融合表达时p26为过量表达有关。 4.BmNPV orf122(Bm122)基因分析 Bm122位于BmNPV(T3株)基因组116325-116928m,读码框全长606bp,编码201个氨基酸,预测分子量约为22.9kDa。在Bm122起始密码子ATG上游240和189nts处分别有一杆状病毒早期转录基序CAGT和TATA框。RT-PCR及Ara-C抑制试验分析表明Bm122转录起始于2.5h p.i.,瞬时转录分析表明Bm122能够利用宿主RNApolymeraseⅡ进行转录;表明Bm122是一个早期基因。亚细胞定位分析发现其表达产物主要积聚在细胞核中,这表明Bm122可能与病毒DNA的复制或晚期基因的表达有关。


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