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水稻细菌性谷枯病菌的风险分析、鉴定检测及其拮抗细菌的研究

罗金燕  
【摘要】: 水稻细菌性谷枯病菌Burkholderia glumae引起谷枯和苗腐,已对发生国家的水稻生产构成重大威胁。我国除台湾外,还没有该病害的发生报道,由于其检疫重要性,农业部拟将其列入进境检疫性有害生物,然而,国内有关该菌的研究尚是空白。 本论文研究主要进行了水稻细菌性谷枯病菌的定量风险分析;浙江与黑龙江省部分主栽水稻品种对水稻细菌谷枯病的抗性分析;中国水稻稻种内潜伏谷枯病菌的分离鉴定;免疫吸附富集(ISE)方法和经典PCR方法结合等检测技术;水稻稻种水稻细菌性谷枯病拮抗细菌评价及生防效果测定。取得了如下主要研究结果: 1.本研究在收集资料和试验的基础上,结合我国的实际情况,参照国际植物检疫措施的标准和国内有害生物风险分析实例,构建了以有害生物为起点的水稻细菌性谷枯病菌的风险分析(PRA)体系,首次应用生物安全评估公式R=f(S,P)的简化公式R=S×P去运算水稻细菌性谷枯病的风险系数(R),客观的解决了有害生物风险与主要的风险相关因子之间的运算关系,简化了PRA程序,缩短了PRA的时间,运算出风险系数R=8.4,属于高度危险有害生物(R值在6-9为高度危险有害生物);用已经发表的有害生物评估指标的体系对该体系进行了初步验证,R值为2.13(R值在2-2.5内为高度危险有害生物),也显示属于高度危险性有害生物,证明了所建立的水稻细菌性谷枯病的PRA体系是可行的。确定了水稻细菌性谷枯病在我国属于高度危险性有害生物,并提出了相关的风险管理措施。这是中国首次对水稻细菌性谷枯病菌进行的定量风险分析。 2.本研究在抽穗期通过对18个主栽水稻品种接种4株B.glumae,结果显示所有的水稻品种均呈现不同程度的感病,没有发现抗病品种,水稻品种以空育131最为感病,丙9904表现中抗;病原菌株以B2012致病性最强,B.2012b致病性最弱。以浓度10~8cfu/ml的B.glumae悬浮液接种稻种,病菌对稻种的发芽率并无影响,但可以引起98%的秧苗腐败枯死;孕穗期以注射法接种上述浓度的菌恳液于剑叶叶鞘内侧,使病原细菌直接与幼穗接触,叶鞘和幼穗皆被感染,发生病变呈现深褐色;孕穗期以喷雾法接种上述浓度的菌悬液,未发现叶鞘的病变,但会引起60%以上以上的谷粒被侵染而呈现不饱实;在抽穗期以喷雾法接种上述浓度的菌悬液,也未见叶鞘的病变现象,稻穗对B.glumae菌株在抽穗前2日至抽穗后2日期间最为感病。 3.为明确我国水稻稻种上是否存在水稻细菌性谷枯病菌,以及早防范该病。经对623份样品的多年病原分离监测,于2006年在2份浙江省来自海南的从未见明显水稻细菌性谷枯病症状的籼稻稻种上分离出6株病原细菌,经25项主要细菌学特性、菌落形态、致病性、BIOLOG、脂肪酸分析、RAPD-PCR鉴定及与4株标准菌株比较,证实了它们系Burkholderia glumae,是引起水稻细菌性谷枯病的病原。B.glumae分离率为0.32%,这是中国大陆首次证实“健康稻种”也存在水稻细菌性谷枯病菌。 4.本研究将免疫吸附富集(ISE)和经典PCR结合以提高检测效率,并且利用多克隆抗体技术成功的获得了4种抗血清,即抗Burkholderia glumae全菌体血清ASBg14、ASBg32、ASBg26和ASBg04,ODD法测定该4种抗血清的效价均达到1:32以上,利用凝聚法测定的效价所有抗血清的效价也均达到了1:5120以上,通过两种方法结合测定效价均显示为合格抗体。通过对4种抗血清的专化性进行研究,结果显示ASBg14和ASBg32专化性较高,抗血清ASBg26和ASBg04专化性不是很理想。用直接PCR技术和免疫捕捉PCR技术检测谷枯病菌,结果表明,所有谷桔病菌都能产生500bp左右的特异性片段,非谷枯病菌的8个菌株均无特异性片段产生。两种检测方法的灵敏度比较发现,直接PCR技术能检测到1×10~5cfu/ml左右的悬浮液,免疫捕捉PCR技术能检测到10~3cfu/ml左右悬浮液,免疫捕捉PCR比直接PCR灵敏性提高10~2倍。检测人工接种的病稻种实验中,直接PCR技术能检测到2粒及以上带菌种子制得浸悬液,而免疫捕捉PCR技术仅1粒带菌种子即可。 5.从432份随机采集的水稻样品中分离到4253个细菌分离物,在离体条件下测定它们对水稻谷枯病菌的拮抗能力,结果显示,有23个菌株对谷枯病菌有很好拮抗效果,其中有40%谷枯病拮抗菌对水稻纹枯病、水稻恶苗病和水稻细菌性条斑病菌也产生了较好的生防效果,表现出一定的广谱性;对5株拮抗活性较高的菌株进行了细菌代谢产物的活性测定,2株拮抗细菌(T021、S087)的培养滤液对水稻谷枯枯病菌有较高的拮抗活性,其中T021对B.glumae和水稻纹枯病菌的拮抗活性分别达到了50.2%和51.4%;通过对水稻生长的影响情况进行试验,结果显示菌株T021不但对稻种的出苗率没有影响而且能够显著促进秧苗和根的生长。由于T021具有的优点,对其进行了系统的鉴定,应用传统的表型特性数值分析、碳源利用(BIOLOG)、脂肪酸甲基酯(FAMEs)分析以及16S rDNA序列分析技术去去确定其分类地位,最终确定T021为Pseudomonas aeruginosa。


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