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水稻螟虫嗅觉相关蛋白基因的克隆、表达及功能分析

巩中军  
【摘要】: 二化螟Chilo suppressalis(Walker),属鳞翅目螟蛾科,是我国水稻上一种重要的害虫。昆虫嗅觉在感受气味物质、寻找寄主、交配等方面起着重要的作用。在对二化螟触角感器有一定了解的基础上,有必要对其嗅觉识别的分子机制进行研究,阐明嗅觉反应的本质原因,找到新的作用靶标,为筛选、研究安全高效的引诱剂、趋避剂等提供帮助;同时昆虫作为良好的模式生物,对其嗅觉的研究能够有助于深入研究人类嗅觉的本质。本研究通过RT-PCR、RACE克隆得到了嗅觉相关的蛋白基因,原核系统表达纯化了蛋白、并对蛋白的功能进行了研究。获得的主要结果如下: 1.利用RT-PCR和RACE方法得到了鳞翅目螟蛾科昆虫二化螟gobp2全长基因。该基因最大编码框为489个核苷酸,编码162个氨基酸残基,预测的分子量为18.192kDa,等电点为5.08,前21个编码氨基酸为信号肽序列,具有气味结合蛋白的典型特征。成功构建了CsupGOBP2的原核表达载体pET30a/CsupGOBP2,并在大肠杆菌中成功表达,经过亲和层析和凝胶过滤获得高纯度的蛋白,免疫家兔制备了多克隆抗体。通过RT-PCR和Western blot方法对二化螟gobp2基因在mRNA水平和蛋白水平的表达谱进行了分析,结果表明GOBP2在二化螟雌雄虫触角中都表达且表达量相同。 以(N-phenyl-l-naphthylamine)1-NPN为荧光探针,利用荧光结合实验方法对纯化蛋白的功能进行了分析,结果表明1-NPN结合在蛋白结构的内部,来自水稻挥发物和性信息素成分的各种气味分子对1-NPN/GOBP2复合物中的1-NPN有不同的竞争能力,cls-11-hexadecenal和Laurinaldehyd两种醛类物质对1-NPN竞争能力最强,表明在所检测的17种物质中这两种物质对GOBP2结合能力最强。 2.应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中在昆虫细胞Tn中表达了二化螟GOBP2蛋白,用His-Tag单抗及兔多克隆抗体进行Western blot分析结果证实表达的蛋白为His与GOBP2的融合蛋白。 3.克隆了大螟、稻纵卷叶螟gobp2基因部分cDNA序列,对CsupGOBP2、SinfGOBP2、CmedGOBP2的序列分析结果表明该基因在一定程度上反映了鳞翅目昆虫亲缘关系的远近,与形态上的分科结果是一致的。 4.利用RT-PCR和RACE技术克隆了二化螟gobpl基因全长序列,该基因最大编码框为522个核苷酸,编码173个氨基酸残基,预测的分子量为20.039kDa,等电点为4.84。推断的信号肽为前22个氨基酸。对3'末端的扩增首次发现该基因的3'UTR可能存在长度不同的转录本;成功构建了该基因的原核表达载体pET30a/CsupGOBP1,制备了兔多克隆抗体,利用荧光结合实验对该蛋白对不同气味分子的检测结果表明所检测的气味分子对荧光探针1-NPN的竞争能力都很弱,说明对蛋白的结合能力较弱。 5.利用RT-PCR和RACE方法成功克隆了二化螟pbp2基因全长cDNA序列,并对基因组序列进行了扩增。该基因最大编码框为498个核苷酸,编码165个氨基酸残基,预测的分子量为18.554 kDa,等电点为4.71。PBP2序列片段经Signal3.0分析表明该蛋白推断的信号肽及最大可能的切割位点为前21个氨基酸。 对pbp2基因组的分析表明该基因具有相同的3个外显子-2个内含子结构,仅在长度上存在较大差异。外显子1和外显子2在昆虫PBP基因进化中大小一致,而外显子3则变异较大。同时内含子的插入位点在该基因中也是很保守的,第1、2个内含子分别在编码蛋白的Glu22、Ala82(Ala81)位氨基酸之后插入,但插入的内含子的长度变异较大(76bp-437 bp、104 bp-1251 bp)。 构建了pET30a/CsupPBP2原核表达载体,割胶回收的蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,对纯化的蛋白利用内源荧光的变化对二化螟三种信息素成分Z11-16:Ald、Z9:16:Ald、Z13-18:Ald的测定结果表明Z11-16:Ald对蛋白内源荧光有明显的淬灭作用,而Z9:16:Ald、Z13-18:Ald对荧光的淬灭作用不大. 6.通过已报道的其它昆虫的基因序列信息设计兼并引物扩增了二化螟、大螟的OR受体基因,结果表明二化螟、大螟中有该受体基因的表达,与鳞翅目其它种昆虫序列相似性很高,在整个昆虫种群中高度保守。在原核系统中的表达没有成功。 7.构建了二化螟触角cDNA文库,酶切鉴定及通过PCR方法从文库中筛选CsupGOBP1、CsupGPBP2、CsupPBP2基因的结果显示构建的文库质量较好,满足筛选相关基因的要求。


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