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《浙江大学》 2007年
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本氏烟与番茄AtTOM类基因克隆与功能初步分析

谭钟  
【摘要】: 在病毒侵染植物过程中由于病毒本身只携带少量的基因,其编码的蛋白远不足以完成整个病毒侵染过程,因此必需借助于寄主因子来实现侵染。近年来已在植物中发现一些寄主因子与病毒的复制有关,如拟南芥中的AtTOM1基因与烟草花叶病毒(TMV)的复制相关,三生烟上鉴定的NtTOM1和NtTOM3及本氏烟上鉴定的NbTOM1也与TMV的复制相关。 本论文根据已报道的三生烟的NtTOM1和NtTOM3基因序列(AB193039,AB193040)设计特异引物,利用RT-PCR从本氏烟扩增到NbTOM1和NbTOM3的基因片段。序列分析表明,NbTOM1和NbTOM3与三生烟中NtTOM1和NtTOM3的同源性分别为95.9%和98.2%。将NbTOM1和NbTOM3插入到烟草曲茎病毒(TbCSV)卫星分子DNA1的沉默载体中,得到DNA1:TOM1、DNA1:TOM3和DNA1:TOM1-TOM3三个重组质粒,重组质粒利用三亲交配法导入农杆菌,并与中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)共同接种本氏烟。接种14天后半定量PCR分析表明,在接种了DNA1:TOM1的植株中NtTOM1基因被沉默而NtTOM3的mRNA水平未受影响;而接种了DNA1:TOM3的植株中NtTOM3基因被沉默而NtTOM1的mRNA水平未受影响;接种DNA1:TOM1-TOM3的植株,两个基因被同时沉默。沉默植株接种TMV:GFP,GFP观察和Northern blot分析表明,单独沉默NbTOM1或NbTOM3与两者同时沉默的植株中TMV病毒的增殖受抑制。上述结果表明,NbTOM3可能与NbTOM1具有相似的机制支持TMV复制。 利用已报道的番茄中AtTOM1类基因序列(AB193041,AB193042,AB193043)设计的特异引物从番茄中扩增了AtTOM1类基因片段(LeTH1,LeTH2,LeTH3),并将其插入同一TbCSV卫星分子DNA1沉默载体中获得重组质粒DNA1:LeTH1-LeTH2-LeTH3。重组质粒利用三亲交配法导入农杆菌后与TYLCCNV共同接种番茄。接种20天后半定量PCR分析表明,重组质粒与TYLCCNV共同接种番茄后,几个基因可同时被沉默,当沉默后的植株接种TMV:GFP后,GFP观察和Northern blot分析表明TMV复制受抑制。这几个基因分别对TMV复制的影响及是否存在功能冗余还有待进一步的分析。 本论文所用的TbCSV DNA1沉默体系,其沉默效率高,接种植物无症状,可以有效地用于快速鉴定基因功能。而利用VIGS体系沉默寄主植物的TOM类因子不失为一种快速获得抗TMV植株的方法。
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