5-氨基乙酰丙酸脱水酶的克隆表达与酶学性质的初步研究

【摘要】： 5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)是生物体内四吡咯化合物(如亚铁血红素、卟啉、叶绿素和维生素B_(12)等)的共同前体,广泛存在于微生物、植物和动物细胞中。近年来,研究发现ALA不仅可作绿色除草剂和生物杀虫剂,还可用于癌症治疗、皮肤病治疗、铅中毒检测等领域,是一种非常有前途的光动力学药物。 本实验室已利用生物体内的碳四途径,成功构建了高产ALA的重组大肠杆菌。通过过量表达ALA合成酶催化琥珀酰辅酶A和甘氨酸的缩合反应,使得AlA的发酵水平到达了6.6g/L(50 mM)。 5-氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD,又名胆色素原合成酶PBGS,E.C.4.2.1.24)能够催化两分子ALA不对称缩合形成胆色素原。作为ALA代谢途径的下游酶,在重组工程菌的发酵生产过程中,脱水酶会导致ALA积累量的减少,但缺乏该酶又会影响细胞的正常生理活动。因此,深入了解ALAD的酶催化动力学特征,采用一定的手段在产ALA期间部分抑制ALAD的活性,就有可能进一步提高ALA产量。 本工作将大肠杆菌Rosseta(DE3)的ALAD基因(hemB)克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,重组质粒命名为pET28a-hemB。将pET28a-hemB转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,成功构建了重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-hemB,并使融合蛋白带上6His亲和标签。重组菌经1mM IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果显示,在36.5 kD处蛋白获得过量表达,经改良的Ehrlich试剂显色反应测定ALAD活力,结果发现重组ALAD比活力达到3.10×10~3U/mg protein。 研究重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-hemB生产5-氨基乙酰丙酸脱水酶的诱导条件,确定了摇瓶发酵的最优诱导条件为:发酵开始后2h添加诱导剂,诱导剂IPTG终浓度为0.4 mM,诱导后的培养温度为28℃,诱导后的表达时间以4 h为宜。通过亲和层析、凝胶过滤层析和冷冻干燥三个步骤得到5-氨基乙酰丙酸脱水酶纯品。经过整个分离纯化过程,5-氨基乙酰丙酸脱水酶的比活力提高了6.19倍。 对重组ALA脱水酶进行了一系列酶学性质的研究,该酶的最适pH值为7.5,最适反应温度为37℃,Km为0.569 mM,Mn~(2+)、Ca~(2+)和K~+能够显著提高酶活力,Cu~(2+)和Li~+显著抑制了酶活力,10 mM金属离子螯合剂EDTA可导致近90%的酶活力丧失,Mg~(2+)对酶活性起着重要作用,低浓度的二硫苏糖醇能够提高ALA脱水酶活性,底物类似物乙酰丙酸、D-葡萄糖以及D-木糖对该酶有着显著的抑制作用。