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纳他霉素高产菌株空间育种、工艺优化及工业放大研究

梁景乐  
【摘要】: 本文对发酵法生产纳他霉素的全过程进行了系统深入的研究和开发。以褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)ATCC13326为出发菌株,对该菌株进行航天搭载等诱变育种获得了高产菌株,通过对培养基组成和发酵工艺的优化,进一步大幅度提高了纳他霉素的产量,在控制溶氧水平的原则指导下,成功地将发酵罐规模从实验室放大到18m~3,根据对纳他霉素的稳定性及溶解性的研究结果,提出了绿色环保、收率高的非溶媒提取工艺。本文的主要研究成果包括: (1)建立了发酵液中纳他霉素含量快速测定的双波长紫外分光度法。该方法具有操作简便、准确快捷的特点,可以用于大批量样品的快速分析,为菌种高通量筛选与发酵工艺的研究提供了可靠的快速分析方法。 (2)以褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)ATCC13326为出发菌株,经过紫外线、紫外线复合氯化锂、空间搭载育种及2-脱氧葡萄糖耐受菌株推理选育等步骤,得到了一株解除了葡萄糖代谢产物阻遏的菌株LK04-119。该菌株在以葡萄糖为唯一碳源的情况下,纳他霉素的生产能力不受葡萄糖效应的影响,摇瓶发酵单位达到了1920mg/l,比出发菌株ATCC13326的发酵单位318mg/l提高了5倍以上。 (3)通过试验确定了纳他霉素斜面培养温度、种子培养温度、种子培养时间和接种量:确定了纳他霉素发酵培养的最适温度、发酵培养基的初始pH值、摇瓶发酵周期。进一步采用正交设计及旋转组合设计进行了纳他霉素种子及发酵配方的优化。通过摇瓶试验分别确定了纳他霉素的斜面培养基、种子培养基及发酵培养基配方。纳他霉素摇瓶发酵单位最高达到了5054mg/l,比发酵起始培养基发酵单位1975mg/l提高了1.56倍。 (4)考察了2碳至4碳单位的盐类、酸类、醇类、酯类等前体性物质对纳他霉素生物合成的影响。结果表明盐类及酸类前体体物质抑制纳他霉素合成,醇类及酯类前体性物质则促进纳他霉素合成。丙酸钠对纳他霉素合成的抑制作用最强,而正丙醇则对纳他霉素发酵的促进作用最好。氨基酸对纳他霉素的生长合成也有一定影响,其中,0.5g/l的L-缬氨酸可以提高纳他霉素产量达到27.0%;而加入2g/1的天冬氨酸将使纳他霉素产量减少51.5%。 (5)在301发酵罐中进行了高产菌株LK04-196分批发酵生产纳他霉素的试验,确定了最优控制条件,使纳他霉素发酵单位平均达到了3784mg/1,最高达到了3902mg/l。通过对分批发酵过程典型代谢过程的分析,确定了流加补糖策略:控制纳他霉素发酵过程中的糖浓度在35g/l以上,补料时间24小时,可以延长发酵周期至120小时,纳他霉素发酵单位可提高34.6%,达到了5094mg/l。 (6)以纳他霉素301发酵罐控制工艺为基础,通过调整通气量及搅拌速度,控制发酵过程中的溶氧水平,成功地实现了纳他霉素分批发酵规模的放大,在1 m~3、4 m~3及18 m~3发酵罐中纳他霉素产量分别达到了4.26g/l、4.05g/l及3.83g/l。建立了支持向量机模型,该模型通过对发酵过程的学习,可以较好地模拟并预测工业放大过程中各级发酵规模的代谢过程。在18 m~3发酵罐中流加发酵的纳他霉素产量达到了5.07g/l,与301发酵罐的产量类似。 (7)研究了pH值、温度、溶媒比例及缓冲物质浓度对纳他霉素稳定性的影响,研究了纳他霉素的降解过程,对纳他霉素的水解动力学进行了研究,同时还发现了在发酵液中纳他霉素的稳定性大大高于纯水中,并研究了pH值对纳他霉素在水中溶解度的影响。在上述研究的基础上提出一条绿色环保、操作简单、成本较低的非溶媒提取工艺。采用该工艺制备了高纯度纳他霉素样品。对纳他霉素产品进行了全面的结构鉴定,证明产品结构与文献报道的纳他霉素化学结构完全一致。 本论文的创新之处在于:建立了发酵液中纳他霉素双波长分光度分析方法;利用空间搭载育种结合推理选育技术,筛选得到了一株完全解除葡萄糖阻遏的菌株;采用控制发酵过程溶氧水平的方法,成功地实现了纳他霉素发酵的工业放大;以纳他霉素在发酵液及水溶液中的稳定性及溶解性研究为基础,提出了纳他霉素绿色、环保、非溶媒提取工艺。 在以上研究工作的基础上,在山东鲁抗医药股份有限公司成功地实现了纳他霉素工业化生产。


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