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白细胞介素-2对糖尿病性心血管功能改变的影响及其相关机制研究

王会平  
【摘要】: 糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种常见的,由胰岛素分泌及或作用缺陷引起的慢性内分泌代谢性疾病,慢性高血糖为其特征。其发病率呈逐年迅速增长趋势。糖尿病已日益成为危害现代人类健康,影响人们生活质量的一种重要疾病。糖尿病的根本危害在于其各种并发症,它可累及全身各重要器官,尤以心血管系统最容易受累。心血管疾病是糖尿病的最主要并发症,也是糖尿病病人最主要的死亡原因。探求糖尿病及糖尿病性心血管并发症的发生发展机制、发掘有效的早期糖尿病心血管并发症的防治措施是心血管科学工作者努力的目标,这对国家国民经济发展、提高人民健康水平具有重大意义。 糖尿病的病因及发病机制尚未完全阐明,近年来炎症学说备受关注,认为炎症在其发病机制中起重要的媒介作用。许多细胞因子包括多种白细胞介素(interleukin,IL)介导了这种炎症反应。白细胞介素作为小分子调节蛋白可以通过内分泌、旁分泌和自分泌的作用方式加速或抑制这种炎症反应过程。研究发现与糖尿病相关的白细胞介素主要包括IL-1至IL-29。这些细胞因子中有些对糖尿病的发生发展具有有害作用,有些则具有有益作用。其中IL-2与糖尿病的发病和进程,以及糖尿病相关的心血管疾病的关系最为密切,而且IL-2还具有炎症和免疫系统之外的重要调节作用。如糖尿病患者或动物血浆中的细胞因子IL-2水平发生明显改变,胰岛素依赖型糖尿病患者胰腺及非肥胖糖尿病小鼠中IL-2表达未见增高,并且通过全身给药IL-2能阻止非肥胖糖尿病小鼠的病程。研究还显示IL-2与缺血性心脏疾补叵得芮?在急性缺血性综合征和稳定性心绞痛病人血浆中IL-2水平明显增高。本实验室的研究表明,IL-2预处理大鼠心肌细胞可明显减弱心脏的缺氧/复氧损伤,而且在离体血管标本,IL-2可引起内皮依赖性的血管舒张作用。本研究的前期实验也发现IL-2可明显减弱高糖诱导的胸主动脉内皮功能损伤。因此,我们推测IL-2有可能在糖尿病性心血管功能改变中发挥重要作用,可能具有改善糖尿病心血管并发症的效应。但目前未见相关报道。 本工作通过对IL-2对糖尿病情况下心血管功能的调控研究,阐明IL-2在糖尿病心血管疾病中的地位和作用。从全新的角度探讨糖尿病心血管并发症的防治措施,为临床控制糖尿病和其心血管并发症提供新的思路和靶点。 目的 1.在离体和在体水平观察IL-2对正常大鼠心肌收缩功能和血管舒张功能的影响,并探讨其可能的作用机制。 2.利用离体和在体动物实验观察链脲佐菌素(STZ)诱导的早期糖尿病大鼠心血管功能的变化。 3.采用慢性整体给药和急性离体孵育方法观察IL-2对STZ诱导的糖尿病大鼠或高葡萄糖浓度孵育的离体胸主动脉舒张功能的影响,并对其可能的相关机制进行研究。 4.采用慢性整体给药的方法观察IL-2对STZ诱导的糖尿病大鼠心脏功能的作用,并探讨其相关机制。 方法 1.酶解分离成鼠心室肌细胞模型:观察单个心肌细胞收缩和心肌细胞内钙瞬态指标; 2.计算机辅助的MedEase视频跟踪法:检测单个心室肌细胞收缩参数; 3.细胞内双波长钙荧光系统:检测细胞内游离钙离子浓度; 4.激光扫描共聚焦显微术:检测细胞内NO生成量; 5.超声心动图:评价大鼠心脏功能动态变化; 6.心室插管法:记录血流动力学各指标; 7.紫外分光光度法:检测组织NOS、SOD、GSH-PX活性和血清NO含量;检测线粒体通透性转换孔开放状态; 8.血管环灌流方法:测定离体大鼠胸主动脉环张力变化; 9.糖尿病大鼠模型构建:一次性腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导Ⅰ型糖尿病; 10.离体心脏灌流:测定离体心脏冠状动脉灌流压; 11.HE染色:观察心肌组织形态; 12.Masson染色:观察心肌组织中胶原含量和分布; 13.Trizol法提取总RNA,RT-PCR一步法进行逆转录和扩增,采用Bio-Rad Gel Doc1000成像系统采集实验结果图像,用Quantity One软件对图像进行灰度扫描,测定样本BCL-2、TGF-β_1mRNA的相对表达量。 结果 一.白细胞介素-2对正常大鼠心血管功能的影响及其可能机制 1.与对照组相比,正常大鼠皮下注射IL-2七周后,心脏超声显示左室射血分数显著降低,左室短轴缩短率(FS%)显著降低,室间隔缩短率(IVS%)及左室后壁缩短率(LVPW%)均显著降低。左室舒张末期内径(LVIDd)与对照组相比无显著差异。 2.与对照组相比,正常大鼠皮下注射IL-2七周后,血流动力学指标显示左室收缩压(LVSP)、左室发展压(LVDP)、收缩及舒张时间变化率(+dP/dt_(max))均显著降低,而左室舒张末压(LVEDP)无显著差异。 3.与对照组相比,正常大鼠皮下注射IL-2七周后,大鼠血清NO水平显著升高。 4.IL-2对大鼠心室肌细胞最大收缩幅度(dL)、最大收缩速度(+dL/dtmax)、最大舒张速度(-dL/dtmax)和舒张末期细胞长度具有明显抑制作用,且呈浓度依赖性特征。 5.在NO合酶抑制剂L-NAME(100μmol/L)或可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)抑制剂ODQ(10μmol/L)存在的情况下,IL-2对心室肌细胞dL、+dL/dtmax、-dL/dtmax和舒张末期细胞长度的抑制作用明显减弱。 6.IL-2可时间依赖性和浓度依赖性地增强心肌细胞内DAF-FM的荧光强度,表明IL-2可激发NO生成。NOS抑制剂L-NAME可明显减弱IL-2的效应。 7.IL-2显著降低单个心室肌细胞电刺激诱导的钙瞬变的幅度。ODQ(10μmol/L)预处理心室肌细胞10min可明显减弱IL-2对心肌细胞钙瞬态的抑制作用。 8.皮下注射IL-2可明显增强大鼠胸主动脉的内皮依赖性舒张反应,对NO供体SNP诱导的非内皮依赖性舒张反应无显著影响。 9.离体情况下,IL-2明显增强主动脉环的内皮依赖性舒张反应,对SNP诱发的非内皮依赖性舒张反应无明显影响。 10.离体情况下,IL-2能显著增强胸主动脉组织的tNOS及cNOS活性。 二.早期糖尿病情况下心血管功能的改变 1.糖尿病制模后7周,糖尿病组大鼠体重未出现与正常对照组相同的增长,反而进行性下降,消瘦,毛发失去光泽,多饮多尿。糖尿病大鼠血糖显著高于正常对照组。 2.糖尿病制模后7周,糖尿病大鼠的心室重/体重比,肝脏重/体重比,肾脏重/体重比值与正常对照组相比明显增加。 3.心脏超声显示糖尿病大鼠左室射血分数、左室短轴缩短率(FS%)、室间隔缩短率(IVS%)及左室后壁缩短率(LVPW%)均显著降低。而左室舒张末期内径(LVIDd)较正常对照组减小。 4.糖尿病组血流动力学指标左室收缩压(LVSP)、左室发展压(LVDP)、收缩及舒张时间变化率(±dP/dt_(max))均显著降低,而左室舒张末压(LVEDP)显著抬高。糖尿病组心率显著低于正常对照组。 5.与对照组相比,糖尿病组大鼠胸主动脉环对ACh诱导的内皮依赖性舒张反应显著降低,对NO供体SNP诱导的非内皮依赖性舒张反应无明显变化。 6.高糖孵育5 h可显著降低ACh诱发的内皮依赖性血管舒张反应,对SNP诱导的非内皮依赖性舒张反应无明显影响。 三.白细胞介素-2对糖尿病大鼠血管功能的作用及其机制研究 1.皮下注射IL-2(5000 or 50000 U/kg)7周对糖尿病大鼠的血糖水平无明显影响,但明显抑制糖尿病大鼠体重下降。 2.皮下注射IL-2七周可明显改善ACh诱导的糖尿病大鼠胸主动脉内皮依赖性舒张反应,对SNP诱导的非内皮依赖性舒张反应无明显影响。 3.高剂量IL-2处理可明显提高糖尿病大鼠血清NO水平。 4.在离体实验条件下,IL-2预处理显著抑制高浓度葡萄糖诱导的内皮依赖性血管舒张功能下降。NOS抑制剂L-NAME可明显减弱IL-2的作用。IL-2预处理对SNP诱导的非内皮依赖性舒张反应无明显影响。 5.IL-2预处理可显著抑制高糖诱发的胸主动脉组织NOS及SOD活性的降低。IL-2也可显著提高正常葡萄糖浓度下胸主动脉组织tNOS及cNOS活性。 6.含高浓度葡萄糖(33.3 mmol/L)K-H液灌流离体心脏时,其CPP明显升高;IL-2(200U/ml)灌流10 min后能显著抑制高浓度葡萄糖诱发的CPP升高,选择性κ-阿片受体阻断剂nor-binaltorphimine(nor-BNI)预处理并不能减弱IL-2的这种效应。 四.白细胞介素-2对糖尿病大鼠心脏功能改变的影响及其相关机制 1.糖尿病大鼠血浆总胆固醇与对照组相比显著增高;IL-2处理对正常和糖尿病大鼠的血浆胆固醇水平均无明显影响。 2.大剂量IL-2处理可明显降低糖尿病大鼠的心室重/体重比。 3.与糖尿病组大鼠相比,糖尿病大鼠IL-2处理后,心脏超声显示左室收缩末期内径(LVIDs)显著缩小,左室舒张末期内径(LVIDd)没有显著性改变,左室射血分数(LVEF),左室短轴缩短率(FS%)显著提高,室间隔缩短率(IVS%)及左室后壁缩短率(LVPW%)均有所增加。 4.大剂量IL-2处理可明显提高糖尿病大鼠的左室收缩压(LVSP)、收缩及舒张时间变化率(±dP/dt_(max)),但对左室舒张末压(LVEDP)无明显影响;IL-2处理对糖尿病大鼠的心率无明显影响。 5.糖尿病大鼠心肌细胞排列紊乱,细胞间隙增宽,有局灶性坏死,大剂量IL-2处理后此表现明显改善。糖尿病组心肌小血管周围外膜有胶原堆积,向周围间质延伸,肌间隙中胶原增多,排列紊乱,横截面观呈栅栏状紧裹心肌细胞。IL-2处理后,可见心肌壁内冠状小动脉外膜胶原沉积量显著减少,肌间隙中胶原量减少,未见条索状分隔心肌细胞。IL-2处理可明显降低糖尿病大鼠心肌胶原容积分数(CVF)和血管周围胶原面积(PVCA)。 6.糖尿病大鼠心肌组织谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性明显降低,大剂量IL-2处理可明显减轻其活性的降低。 7.糖尿病大鼠心肌Bcl L-2mRNA表达显著减少,而大剂量IL-2处理可明显增加其Bcl-2mRNA表达。糖尿病大鼠心肌TGF-β1mRNA表达显著增加,而IL-2处理可显著降低其TGF-β1 mRNA的表达。 8.糖尿病大鼠心肌线粒体在加入200μmol/L的CaCl_2后,A_(520)下降程度比正常对照组小。与糖尿病组相比,IL-2处理(5000,50000 U/kg)组糖尿病大鼠心肌线粒体在加入200μmol/L的CaCl_2后,A_(520)下降程度无明显差别。 结论 1.IL-2慢性处理对整体情况下大鼠的心脏收缩功能具有明显抑制作用。急性应用IL-2对大鼠心肌细胞收缩功能具有直接抑制作用,其机制可能通过刺激NOS活性,增加NO的生成,激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)从而增加心肌细胞内第二信使cGMP的生成量,导致细胞内Ca~(2+)含量降低所致。IL-2明显提高ACh诱发的血管内皮依赖性舒张功能,该作用可能与IL-2提高血管内皮NOS活性,增加NO生成有关。 2.IL-2可明显改善糖尿病(高葡萄糖浓度)诱发的血管内皮依赖性舒张功能减弱,IL-2的这种效应可能与其激活NO通路和增强抗氧化酶活性,减弱氧化应激损伤作用有关。IL-2可减弱高葡萄糖浓度诱发的冠状动脉血管阻力的升高,其作用可能与IL-2激活血管内皮细胞NOS活性有关,而与κ-阿片受体系统无关。 3.早期糖尿病大鼠出现心脏收缩与舒张功能不全,IL-2皮下注射可明显改善其心功能,作用机制可能与IL-2提高TGF-β1mRNA表达,抑制心肌纤维化和提高Bcl L-2mRNA表达,增强心肌抗氧化能力有关,而与心肌线粒体MPTP无关。


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