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线粒体相关通道/孔道作为心肌保护靶点的研究

高琴  
【摘要】: 线粒体是维持细胞存活的关键细胞器。当机体遭受各种应激刺激时,线粒体内ATP含量急剧下降,糖酵解致使各种有害产物堆积,激活某些内在机制,导致细胞凋亡、坏死的发生。心肌缺血复灌时,线粒体功能失常是诱导细胞凋亡和坏死的主要因素之一。如何保护线粒体从而保护心肌免受损伤引起越来越多的重视,线粒体机制已成为研究心肌保护作用的热点。 线粒体内外膜上存在的诸多离子通道/孔道可能参与心肌保护。线粒体渗透性转换孔道(mitochondrial permeability transition pore,mitoPTP)是存在于线粒体内外膜之间的一种非特异性通道,参与对抗缺血/复灌损伤的心肌保护作用,是缺血/复灌损伤的终末效应器之一。mitoPTP的活动可能受其上游的离子通道的调节。线粒体钙单向转运体(mitochonddrialcalcium uniporter,MCU)是介导钙离子从线粒体外进入线粒体基质的重要途径,参与调节线粒体内外钙的动态平衡。线粒体上的两种钾离子相关通道——线粒体ATP敏感性钾通道、线粒体钙激活钾通道调节钾离子进入线粒体,维持线粒体容积,同时调节线粒体钙离子和氧自由基的活动,也参与心肌保护机制。这些离子通道/孔道是否是心肌保护的共有通路,离子通道是否参与调节mitoPTP的活动值得关注。 近年来的研究表明,关于心肌保护的干预措施主要包括缺血预处理、药物预处理和新近出现的缺血后处理。已证实缺血预处理的心肌保护机制涉及促进线粒体ATP敏感性钾通道的开放、抑制线粒体钙单向转运体和线粒体渗透性转换孔道的开放等,药物预处理和后处理是否通过类似的机制发挥心肌保护作用尚未明确。 本研究给予实验动物心肌三种不同类型的干预:内源性细胞因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、外源性药物puerarin及非药物的程序性氧供控制缺血后处理,在离体心脏缺血复灌损伤、心肌细胞缺氧复氧损伤和氧化应激损伤、高钙诱导线粒体损伤等不同层次模型上着重观察不同类型的干预是否均通过共同的线粒体离子通道/孔道的参与和线粒体后的信号转导发挥心肌保护作用。我们着重观察线粒体渗透性转换孔道、线粒体钙激活钾通道和线粒体钙单向转运体、线粒体ATP敏感性钾通道在三种干预中的作用,并进一步探讨其可能的上下游机制。 本实验采用结扎冠状动脉左前降支30 min,复灌120 min复制局部缺血/复灌损伤模型和大鼠心脏全心停灌30 min,复灌120 min复制全心缺血/复灌损伤模型。连续记录离体心脏左心室发展压、左室作功(心率与发展压的乘积)和左室舒张末压力等各项心室力学指标。分光光度法测定冠脉流出液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量;TTC染色法测定心肌梗死面积;测定心肌细胞formazan含量反映心肌细胞活性。分离心肌线粒体,分光光度法测定线粒体高钙诱导下520 nm吸光度的变化反映线粒体渗透性转换孔道的开放。同时建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型和H_2O_2诱导心肌细胞损伤模型,台盼蓝拒染法测定细胞存活率;采用荧光技术测定心肌细胞缺氧线粒体膜电位的变化和氧自由基的变化。 结果发现,在离体心脏缺血/复灌损伤模型上,内源性细胞因子TNF-α预处理明显减少心脏缺血/复灌后的心肌梗死面积,降低复灌期冠脉流出液中LDH含量,促进左室发展压、左室作功和左室舒张末压的恢复。线粒体渗透性转换孔道开放剂atractyloside(Atr)、线粒体钙激活钾通道阻断剂paxilline(Pax)和线粒体钙单向转运体开放剂spermine(Sper)增加了冠脉流出液中LDH含量和心肌梗死面积,减弱了心室收缩功能的恢复。线粒体渗透性转换孔道抑制剂cyclosporin A(CsA)、线粒体钙激活钾通道开放剂NS1619明显减少心脏缺血/复灌后的心肌梗死面积,降低复灌期冠脉流出液中LDH含量,促进左室发展压、左室作功和左室舒张末压的恢复。线粒体钙激活钾通道阻断剂Pax未改变CsA的作用,线粒体渗透性转换孔道开放剂Atr减弱了NS1619的作用。 在分离的心肌线粒体实验模型上,10 U/ml TNF-α预处理离体大鼠心脏后分离线粒体,高钙诱导下520 nm处吸光度的下降明显低于对照组;线粒体钙激活钾通道阻断剂Pax和线粒体钙单向转运体开放剂Sper均减弱了高钙诱导下TNF-α对520 nm处吸光度的影响。 在离体大鼠心脏缺血复灌损伤模型上,外源性药物puerarin明显减小了心肌细胞活度,降低了冠脉流出液中LDH含量,复灌期心室收缩功能恢复程度明显增加。线粒体钙激活钾通道阻断剂Pax、线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-hydroxydecanoate(5-HD)和线粒体渗透性转换孔开放剂Atr均减弱了了puerarin的作用。 在心肌细胞缺氧/复氧损伤模型和H_2O_2诱导损伤模型上,puerarin增加了心肌细胞存活率,Pax、5-HD和Atr和PKC阻断剂chelerytheline减弱了puerarin的作用。采用荧光技术观察心肌细胞。puerarin降低了缺氧诱导下荧光探针TMRE的强度,提示线粒体膜电位去极化程度降低,5-HD和Atr减弱了puerarin的作用。同时puerarin降低了缺氧和H_2O_2诱导下荧光探针DCF的强度,提示线粒体ROS释放减少,Pax和chelerytheline减弱了puerarin的作用。分离心肌线粒体模型上,puerarin预处理离体大鼠心脏后分离线粒体,520 nm处吸光度的下降明显低于对照组:5-HD和Pax减弱了puerarin对520 nm处吸光度的影响。 在离体心脏缺血复灌损伤模型上,非药物的程序性氧供控制——缺血后处理明显提高了心肌细胞活度,降低了冠脉流出液中LDH含量,复灌期心室收缩功能恢复程度明显增高。线粒体钙激活钾通道阻断剂Pax、线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-HD减弱了了缺血后处理对心肌的作用。δ阿片受体阻断剂naltrindole和κ阿片受体阻断剂nor-binaltorphimine均减弱了了缺血后处理对心肌的作用。缺血后处理后分离大鼠心脏线粒体,高钙诱导下后处理组520 nm处吸光度的下降明显低于对照组。 总之,内源性细胞因子TNF-α抗缺血/复灌心肌损伤的作用可能与其抑制线粒体渗透性转换孔道的开放有关,同时抑制了线粒体钙单向转运体的开放,促进了线粒体钙激活钾通道的活动。外源性药物puerarin可发挥抗心肌缺血/复灌损伤和抗氧化作用,其机制可能与其促进线粒体钙激活钾通道和线粒体ATP敏感性钾通道的开放,抑制线粒体渗透性转换孔道的开放有关,同时有PKC的参与。缺血后处理的心肌保护作用机制涉及内源性阿片受体激动剂的释放,以及线粒体钙激活钾通道和线粒体ATP敏感性钾通道的开放。线粒体钙单向转运体、线粒体ATP敏感性钾通道、线粒体钙激活钾通道可能是线粒体渗透性转换孔道的上游途径。 线粒体离子通道/孔道可能是机体重要的心肌保护的共同途径,包括内源性因子、外源性药物和血流程序控制在内的各种干预措施其细胞内作用靶点是线粒体的离子通道/孔道,随后通过线粒体后信号转导发挥心肌保护作用。


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