收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

外源性EGF促细胞增殖作用的信号转导机制和安全性研究及EGF药源开发

袁庆丰  
【摘要】: 表皮生长因子(epidermal growth factor,缩写EGF),是一强有力的细胞分裂因子,主要由颌下腺管细胞分泌。 EGF对上皮细胞有促增殖作用,外源性EGF在临床中的应用开始于创伤治疗方面:如体表创伤、溃疡,角膜损伤等。由于人体大多数的EGF存在于消化道,远远高于循环中的EGF浓度,因此,EGF对消化道黏膜有效的保护作用使外源性EGF用于消化道疾病治疗成为了一个研究热点。研究同时也发现EGF和EGF受体(EGFR)拮抗剂可以影响肿瘤的发生、发展和消退,因此在临床中EGF的应用由于它潜在的安全性问题而受到了制约。由于EGF与EGFR激活及其信号转导通路十分复杂,病理生理功能多样,而Bcl-2、p53基因蛋白表达异常与肿瘤发生、发展有关,故迫切需要进一步研究它们在基础研究和临床实践中的地位。本实验首先检测不同浓度EGF在不同时间段对人胚胎羊膜细胞FL的促增殖作用,进一步检测不同浓度EGF与激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的时效关系以及对Bcl-2、p53蛋白表达的影响,为整体动物实验提供EGF应用的理论依据和实验数据。 目前在临床中已经被采用的EGF外用材料主要来源于基因工程合成或小鼠颌下腺提取,价格十分昂贵,而且来源非常有限,这是制约EGF应用于临床的另一个重要原因。如果不能解决这个问题,即使研究阐明了EGF治疗的信号转导机制并证明其在临床实践中的积极意义,也无法赋予这项研究的现实的理论意义和应用价值。这是使得基础研究的成果具有应用可行性的最基本条件。联系我国目前的实际情况,如能简便,价廉地从家畜腺体提取到有生物学活性的EGF将是一件利国利民的好事。而同时我国每年又有大量的牲畜颌下腺被废弃,因此原材料来源丰富且成本低廉,并且作为重要的经济动物,羊类制品为人类接受程度高,这些都为EGF广阔的应用前景提供了最基本的保障。 本论文的内容分以下两个部分: 第一部分:外源性EGF促FL细胞增殖作用的信号转导机制及其安全性评价研究 目的 探讨EGF促FL细胞增殖时激活Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路时间-剂量-效应关系及对Bcl-2、p53蛋白表达的影响。 材料与方法 1.MTT法检测细胞增殖:细胞以2×10~8/L的密度接种于96孔板上,每孔100μ1。待细胞贴璧生长后换含不同浓度rhEGF(0.1、1、10、30、60μg/L)的无血清培养基继续培养,对照孔以生理盐水代替rhEGF。观察细胞生长形态学变化并分别在第1、2、3、4、5 d取样;或换含rhEGF(10μg/L)+不同浓度PD98059(25、50、75μmol/L)的MEM培养基100μ1,继续培养48 h。取样后每孔加入MTT 20μ1,孵育4 h后弃上清,每孔加150μ1 DMSO,振荡10 min,于酶标仪490 nm波长下测定各孔的吸光度A值。细胞增殖率=(实验组A值-对照组A值)/对照组A值×100%。 2.Western蛋白印迹法检测Ras/Raf/MEK/ERK通路及Bcl-2、p53蛋白水平:待细胞贴璧生长后换用rhEGF终浓度为1、10、60μg/L无血清的MEM培养基继续培养:测定MAPK通路抑制剂PD98059的影响则分别加入终浓度为25,50,75μmol/L的PD98059,预处理1 h。实验开始后根据需要在不同时段用胰酶消化,收集细胞并加细胞裂解液,取上清液,Bradford法测蛋白浓度。每孔加50μg的蛋白样品电泳,电泳结束后转PVDF膜,将转有蛋白的膜置于5%BSA封闭,经一抗和HRP标记的二抗处理后,在暗室,取ECL发光试剂A、B液各1 ml,混合后覆盖于膜上1.5 min,最后用X光胶片进行曝光、显影及定影。 结果 1.FL细胞经培养48小时后,生理盐水对照组基本以多边形居多,而加入rhEGF后细胞以长条纺锤形居多。 2.第1-5天中,1-60μg/L浓度组促细胞增殖率明显增高(P<0.01)。rhEGF浓度10μg/L第3天时达到最高(42.4%,P<0.01),第4、5天后1-60μg/L浓度组促细胞增殖率开始下降,但仍高于对照组(P<0.01)。 3.各浓度PD98059可明显抑制EGF促FL细胞增殖作用(P<0.01),且随着剂量的加大其抑制作用愈明显。 4.不同浓度rhEGF刺激30 min后p-Raf、p-ERK1/2蛋白诱导表达灰度分析结果示rhEGF 1-60μg/L浓度组p-Raf、p-ERK1/2蛋白较对照组明显升高(P<0.05),尤以10μg/L浓度组的作用最强。而非磷酸化ERK 1/2的表达无明显变化。 5.rhEGF浓度10μg/L刺激FL细胞后测定连续时间段(0 min,5 min,30 min,1h,2 h)p-Raf、p-ERK1/2蛋白诱导表达结果示刺激第5 min-2 h各时间段p-Raf、p-ERK1/2活性表达呈峰型曲线,其中第5 min时p-Raf、p-ERK1/2活性最高(P<0.01),随后各时间段p-Raf、p-ERK1/2活性开始下降。2 h后p-Raf表达的水平即明显下降到刺激前的水平,与对照组无明显差别(P>0.05):而2 h后p-ERK1/2表达的水平甚至低于刺激前的水平(P<0.05)。 6.与对照组比较,灰度分析结果示各浓度组PD98059(25,50,75μmol/L)可明显抑制rhEGF促p-ERK1/2蛋白诱导表达(P<0.01)。且PD98059抑制p-ERK1/2蛋白的表达有剂量依赖性,随着PD98059剂量的加大,抑制p-ERK1/2蛋白表达的作用增强。 7.与对照组比较,受不同浓度rhEGF刺激1 h后Bcl-2蛋白表达灰度分析结果示1-60μg/L浓度组Bcl-2蛋白表达较对照组明显增高(P<0.05);rhEGF 1-60μg/L浓度组p53蛋白明显下降(P<0.01)。其中rhEGF 1μg/L浓度组的作用最弱,10μg/L浓度组的最强,两组之间比较有显著差异(P<0.01)。 8.以rhEGF 10μg/L的刺激浓度观测0 min,30 min,1 h,2 h,4 h五个时间段的Bcl-2蛋白诱导表达结果示30 min-4 h时间段的表达呈峰型曲线,以1h时间段的表达最高(P<0.01),随后开始下降。与rhEGF 10μg/L的浓度刺激后p-ERK1/2蛋白的表达水平比较,各时间段Bcl-2与p-ERK1/2的峰型变化曲线基本一致。 结论 EGF促FL细胞增殖、激活Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路及对Bcl-2、p53蛋白的表达有明显的剂量和时间依赖性作用。EGF浓度10μg/L是最强的刺激浓度,FL细胞对此浓度EGF的刺激具有自适应控制作用。1μg/L浓度的EGF可能是既发挥生理效应又较为安全的用量。 第二部分:羊颌下腺表皮生长因子提取、纯化及生物活性鉴定的研究 目的 从山羊颌下腺分离、纯化具有生物学活性的EGF。 方法 1.羊EGF的提取、纯化:首先进行EGF的粗分离,称取山羊颌下腺(新鲜或冷冻),解冻后剪去结缔组织,用剪刀剪成小块,用搅拌机搅碎,然后放入匀浆器匀浆,按比例加入冰醋酸(HAC),操作在4℃冰浴中进行。50 000×g,离心30 min,抽取上清液。进行DEAE Sphacel阴离子交换柱分离,收集洗脱液,UV-280nm检测图分析吸光度,选出的管数做ELISA实验。并以0.2 M醋酸铵和EGF标准品做为阴性、阳性对照,以检测EGF活性成分。不加硫酸(在652nm处的读数)及加酸后(在450nm处读数)的结果分析。读数高、和EGF标准品读数接近为有EGF活性组份的可能,将这些组份合并后进行透析脱去盐分(透析袋分子量为3 500),透析过夜。将透析好的组份分别用甘油(丙三醇)或聚乙二醇(分子量20 000)进行浓缩以除去水分。透析浓缩后的组份再次进行ELISA实验。将含有EGF成分的浓缩液过分子筛色谱(Sephadex G50)柱层析,根据层析图所示,选取对应的收集管再次进行ELISA实验,步骤同前,结果吸光度值高的几管与层析图中的一个峰所对应,因此该峰就是含有EGF的活性峰。 2.对提取、纯化的羊EGF进行生物活性检测 2.1 MTT法测定不同浓度羊EGF对人胚胎羊膜细胞FL的促增殖作用。 2.2流式细胞术检测羊EGF促细胞增殖时细胞周期变化。 3.纯化的山羊颌下腺EGF行SDS-PAGE电泳观测其可见的分子量条带位置。 结果 1.48小时后贴璧生长的FL细胞逐渐以多边形居多,而加入EGF后细胞以长条纺锤形居多。 2.MTT法促增殖实验:结果显示不同浓度羊颌下腺EGF组(稀释倍数:1:100、1:500、1:1000)、rhEGF(10μg/L)组对FL细胞的促增殖率分别为20.90%、39.43%、24.90%和40.60%。与对照组比较,羊颌下腺分离的EGF可明显促进FL细胞的生长(P<0.01),以稀释1:500倍的羊EGF作用效果最强,其促FL细胞增殖率与人重组EGF比较无明显差异(P>0.05)。 3.流式细胞术:根据细胞实验中确立的最佳羊EGF稀释浓度观测流式细胞术中羊EGF对细胞周期的影响,与对照组相比较,结果显示作用48 h后,G_0/G_1期细胞百分比由71.1±1.9减少至60.3±2.2(P<0.01),S期细胞百分比由18.8±1.4增高至25.8±1.1(P<0.01),纯化的山羊颌下腺EGF显著刺激细胞由G_0/G_1期进入S期,使分布在S期的细胞数增加。 3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:电泳结果显示在分子量6 kD处,可见明显的条带。 结论 从山羊颌下腺分离得到的蛋白质经鉴定为EGF,该EGF能明显促进FL细胞生长、显著提高细胞的S期细胞分数,为具有生物学活性的EGF。羊颌下腺可能成为外源性EGF的药源。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 吕仁花;索爱琴;张杰文;赵建华;黄月;;缺血预处理对大鼠皮质神经元缺血耐受性和Bcl-2表达的影响[J];实用诊断与治疗杂志;2007年04期
2 袁庆丰;姒健敏;张啸;张筱凤;吕文;吴加国;陈淑洁;;重组人表皮生长因子对人胚胎羊膜细胞体外增殖的影响[J];中国医院药学杂志;2009年06期
3 李付广;李沛;靳静;董子明;;外周血T淋巴细胞的培养、纯化及鉴定[J];郑州大学学报(医学版);2006年04期
4 陈雯;张明昌;彭云;胡义珍;;黄芩素对人眼球筋膜囊成纤维细胞增生的影响[J];眼科新进展;2007年06期
5 倪玉霞;李澎;李贻奎;束云;;大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定[J];广西医科大学学报;2009年01期
6 吴涛;白海;王存邦;路继红;欧剑锋;王茜;;骨髓间充质干细胞体外分离培养及其生物学特性的初步研究[J];中国综合临床;2007年08期
7 李纾;杨丕山;曹金芳;葛少华;潘克清;;表皮生长因子受体在人牙周膜成纤维细胞体外矿化中的作用[J];华西口腔医学杂志;2006年01期
8 王辉;王岭;李开宗;凌瑞;孙宝华;马福成;李晓军;;人外周血内皮祖细胞的培养与鉴定[J];中国临床康复;2006年29期
9 李中秋;吴雅臻;韩宁;;全反式维甲酸对人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用[J];吉林大学学报(医学版);2008年02期
10 王洪琰;冯晓飞;孟宪利;刘庆熠;;Smac和Bcl-2在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义[J];山西医科大学学报;2009年03期
11 郭尚春;袁霆;芮碧宇;陈欣;孙辉;张长青;曾炳芳;;联合单层培养和三维培养的两步法培养软骨细胞[J];第二军医大学学报;2010年09期
12 丁蔚,牛富文,庞静,付士显;二甲基亚砜对人类食管癌细胞株作用机理的研究[J];郑州大学学报(医学版);1993年03期
13 刘怡;房殿吉;李静远;海波;张春梅;施松涛;王松灵;;小型猪牙周膜细胞体外培养及与三维支架材料的生物相容性研究[J];北京口腔医学;2006年01期
14 赵松,段惠军,齐凤英,李英敏;bcl-2、p53在皮肤肿瘤中的表达及意义[J];肿瘤研究与临床;2005年03期
15 尹礼烘;王慧民;赵凤达;杨香生;周荣伟;;白英诱导人肺癌细胞凋亡及对Bcl-2的影响[J];中国肿瘤临床;2006年24期
16 王哲文;施小茹;李婷钰;周世平;张红;;LPS和PMA对人眼晶状体上皮细胞增殖和EGFR表达的影响[J];吉林大学学报(医学版);2008年04期
17 张淳;周萍;陈卫昌;;EGCG对结肠癌HT-29细胞生长的影响及机制[J];山东医药;2008年26期
18 郑文球;朱敏;;三七皂苷R1诱导HL-60细胞凋亡中survivin、bcl-2的表达[J];浙江中医药大学学报;2007年05期
19 蒋朝华;胡学庆;刘宁飞;;人真皮淋巴管内皮细胞的分离及冷冻保存[J];上海交通大学学报(医学版);2007年09期
20 席桂发;王宝峰;王和平;叶飞;郭东生;雷霆;;EGF和AG1478对GL15细胞增殖、侵袭和GFAP表达的影响[J];中华神经外科疾病研究杂志;2007年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 鲜均明;刘世喜;周光耀;梁传余;;p16β及EGFR反义cDNA干预喉癌细胞信号转导的实验研究[A];中华医学会第十次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议论文汇编(上)[C];2007年
2 金华利;康友敏;王宾;;流式细胞技术在细胞免疫检测中的应用[A];2005全国第二届核酸疫苗研讨会论文集[C];2005年
3 罗刚;朱玲;周黎明;;川陈皮素通过调节Bcl-2与Bax表达诱导A549细胞凋亡[A];中国药理学会第九次全国会员代表大会暨全国药理学术会议论文集[C];2007年
4 王雅茹;张学军;田艳;张兰凤;王志宇;栾天燕;韩强;毕雪冰;;K562及其耐药细胞株K562/A02对rmhTRAIL的敏感性和NF-κB(RelA/P65)相关性研究[A];第五届全国中医药免疫学术研讨会——暨环境·免疫与肿瘤防治综合交叉会议论文汇编[C];2009年
5 孙宝飞;余资江;康朝胜;余彦;傅马;;慢性砷中毒对小鼠齿状回神经细胞中bax和bcl-2蛋白表达的影响[A];中国解剖学会2011年年会论文文摘汇编[C];2011年
6 张尚权;;抗表皮生长因子受体单克隆抗体在肺癌生物治疗中的实验研究[A];第七届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2001年
7 张惠欣;程建新;单保恩;;阿司匹林对卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用及其机制的探讨[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年
8 吴静;葛高翔;林其谁;;表皮生长因子受体体外测活的非同位素方法[A];第七届全国生物膜学术讨论会论文摘要汇编[C];1999年
9 朱楠;张淑兰;牛菊敏;王敏;陆景明;;子宫肌瘤组织中表皮生长因子受体mRNA的表达及意义[A];中国抗癌协会妇科肿瘤专业委员会第六次全国学术会议论文汇编[C];2001年
10 步荣发;布静秋;张海钟;;Irresa在口腔癌中的应用[A];第二届全国口腔颌面—头颈肿瘤内科综合治疗研讨会论文汇编[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 袁庆丰;外源性EGF促细胞增殖作用的信号转导机制和安全性研究及EGF药源开发[D];浙江大学;2007年
2 王旭;涎腺多形性腺瘤基因治疗的实验研究[D];河北医科大学;2005年
3 旷劲松;长期高糖导致胰岛β细胞功能损伤的分子机制[D];中国医科大学;2005年
4 冯东福;胚胎神经干细胞向视网膜神经节细胞诱导分化的实验研究[D];第二军医大学;2005年
5 刘东昕;体外甲床细胞培养、鉴定及组织工程甲床构建的实验研究[D];吉林大学;2006年
6 朱保民;流体剪切力对破骨细胞降钙素受体(CTR)及整合素αVβ3 mRNA表达影响的研究[D];四川大学;2005年
7 胡梦欣;聚丙烯微孔膜的高密度糖基化及其应用基础研究[D];浙江大学;2009年
8 南景龙;C反应蛋白对内皮祖细胞功能的影响及其机制研究[D];中国协和医科大学;2009年
9 何蕾;黄芪注射液抗心肌细胞缺血再灌注损伤作用及机制研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
10 陈军;p27抑制激素抵抗前列腺癌PC3细胞株表皮生长因子受体(EGFR)的研究[D];浙江大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 隋萍;葡多酚对骨髓细胞增殖活性的影响作用研究[D];青岛大学;2004年
2 赵圆;灵芝硒多糖诱导K562细胞凋亡机制的研究[D];辽宁师范大学;2006年
3 许亚萍;Iressa(ZD1839)对肺癌A549细胞系的放射增效作用[D];浙江大学;2006年
4 胡志芳;熊果酸抑制胃腺癌细胞COX-2的表达和诱导凋亡[D];武汉大学;2005年
5 王俊瑞;整合素α5β1在EGF促A549肺腺癌细胞黏附和侵袭中的作用[D];内蒙古医学院;2008年
6 李娜;Sorafenib联合紫杉醇对人肝癌细胞株BEL-7402抑制作用的基础研究[D];大连医科大学;2008年
7 谭洁;熊果酸诱导结肠癌细胞凋亡与caspase-9,bc1-2基因表达的实验研究[D];武汉大学;2005年
8 夏飞;结核分枝杆菌诱导宿主巨噬细胞凋亡机制的研究[D];武汉大学;2005年
9 陈艳华;罗格列酮诱导人急性髓性白血病HL60细胞生长抑制和凋亡作用的实验研究[D];南华大学;2007年
10 张晓宇;HGF基因对血管内皮祖细胞增殖的影响[D];天津医科大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 朱国旺;“流式中国30年”高峰论坛召开[N];中国医药报;2010年
2 刘霞;英利用细胞切除技术降低制药成本[N];科技日报;2008年
3 葛秋芳;美科学家培育出修理心脏的“导线”[N];新华每日电讯;2006年
4 ;用人类自体细胞培养心脏[N];中国中医药报;2000年
5 吴一福;浮萍和紫丹参治疗白癜风有据可依[N];中国医药报;2005年
6 ;健胃愈疡颗粒剂可增加胃黏膜表皮生长因子受体表达[N];中国中医药报;2004年
7 钱铮;日本用鼠肝和胃细胞培养出诱导多功能干细胞[N];新华每日电讯;2008年
8 吴一福;西京医院振荡法支架种植内皮细胞获成功[N];中国医药报;2008年
9 记者 刘道安;天津医生建立细胞培养模型[N];健康报;2001年
10 齐智杰 记者  何秀丽;三个自主创新项目获科技进步一等奖[N];哈尔滨日报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978