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参附注射液对大鼠肢体缺血再灌注损伤的影响

刘文广  
【摘要】: 缺血可引起组织器官的损伤,及时恢复缺血组织器官的血供是其功能和结构得以保存的前提条件。但是,对于缺血时间较长的组织而言恢复血流往往产生更为严重的组织损伤,这一现象称为缺血再灌注损伤。肢体缺血再灌注损伤是临床常见的病理过程,多继发于长时间应用止血带后及肢体血管损伤、急性动脉栓塞、断肢再植等手术治疗后,它不仅引起局部组织损伤甚至导致截肢,而且引发多器官损害,出现肝、肾、肺等功能衰竭,严重危及病人生命。如何减轻肢体缺血再灌注的损伤,降低肢体缺血再灌注后的致残率和死亡率逐渐成为研究的热点。目前认为肢体缺血再灌注损伤的机制主要有:氧自由基的作用,一氧化氮(NitricOxide,NO)作用,钙超载,各种细胞因子的参与以及白细胞和内皮细胞激活导致微循环障碍等。在此基础上肢体缺血再灌注损伤的防治药物研究也逐渐深入,大量研究已经证明如维生素E、甘露醇、异丙酚、促红细胞生成素等药物对肢体缺血再灌注损伤有显著的保护作用。中药对肢体缺血再灌注损伤保护作用的研究也愈来愈受到重视。参附注射液(shenfu injection)是根据祖国医学“回阳救逆”参附汤研制的一种治疗厥脱证的药物,通过分离灭菌水溶液制成,其有效成分为人参皂苷与乌头类生物碱等,具有抗应激、抗氧化、增强机体非特异性抵抗力、改善微循环的作用。本实验建立大鼠肢体缺血再灌注模型,测定血液NO水平、腓肠肌组织中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性、丙二醛(MaleicDialdehyde,MDA)浓度以及钙离子(Ca~(2+))负载;腓肠肌组织提取总RNA,采用RT-PCR半定量分析Bcl-2-mRNA和Bax-mRNA转录水平;观察腓肠肌组织形态学变化。通过观察参附注射液对上述指标的影响,来探讨参附注射液对肢体缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。 采用浙江省医学科学院实验动物中心提供的健康SD大鼠40只,雌雄不拘,体重200-300g。术前常规禁食12小时,自由饮水。3%戊巴比妥钠(事先用蒸馏水和戊巴比妥钠粉剂配制)30mg/kg腹腔内注射麻醉。橡皮止血带环绕结扎双后肢根部阻断血流,使后肢急性缺血趾苍白,温度降低。4小时后松解结扎,恢复血流灌注4小时,后肢颜色恢复红润,制成缺血再灌注模型。 实验动物随机分为5组,每组8只。正常组(A组)8只,仅麻醉及尾静脉注射生理盐水;肢体缺血4小时对照组(B_0组)8只,缺血4小时后放开橡皮止血带,不进行血液再灌注;肢体缺血再灌注4小时对照组(B_4组)8只,缺血4小时后放开橡皮止血带,再灌注4小时;肢体缺血4小时给药组(C_0组)8只,应用参附注射液后缺血4小时,不进行再灌注;肢体缺血再灌注4小时给药组(C_4组)8只,应用参附注射液后缺血4小时,再灌注4小时。参附注射液(雅安三九药业有限公司生产)于肢体缺血前10min经尾静脉注射给药(10ml/kg),正常组(A组)和B_0、B_4组于相同时间给予同等体积的生理盐水。 5组大鼠分别在实验结束后进行解剖,下腔静脉收集血液标本测NO水平。取后肢腓肠肌组织测SOD活性、MDA浓度、Ca~(2+)浓度、半定量分析Bcl-2-mRNA和Bax-mRNA转录水平,HE染色光镜观察形态学变化,透射电镜观察细胞凋亡情况。 以SPSS15.0统计软件包进行统计分析,所有数据均以(?)±s表示,组间样本均数比较采用单因素方差分析,P<0.05为有显著统计学意义。 结果 1.Ca~(2+)负载结果(单位:mg/kg组织湿重):A组:7.18±1.86 B_0组:156.99±20.47B_4组:211.33±53.48 C_0组:30.38±5.86C_4组:157.64±19.47 A组与B_0组间P<0.01;B_4组与B_0组间P<0.05;C_0组与B_0组间P<0.01;C_4组与B_4组间P<0.05 2.SOD结果(单位:U/mg组织):A组:1.88±0.16 B_0组:1.59±0.05B_4组:1.06±0.08 C_0组:1.76±0.10C_4组:1.61±0.05 A组与B_0组间P<0.01;B_4组与B_0组间P<0.01;C_0组与B_0组间P<0.01;C_4组与B_4组间P<0.01 3.MDA结果(单位:nmol/g组织):A组:23.33±6.31 B_0组:71.02±10.37B_4组:97.31±19.68 C_0组:60.56±14.95C_4组:52.32±8.36 A组与B_0组间P<0.01;B_4组与B_0组间P<0.01;C_0组与B_0组间P>0.05;C_4组与B_4组间P<0.01 4.NO结果(单位:μmol/l):A组:21.04±5.47 B_0组:48.70±10.25B_4组:108.84±14.51 C_0组:26.30±5.49C_4组:69.82±16.35 A组与B_0组间P<0.01;B_4组与B_0组间P<0.01;C_0组与B_0组间P<0.01;C_4组与B_4组间P<0.01 5.RT-PCR结果:肢体缺血可导致骨骼肌Bcl-2基因表达、bcl-2/bax的比值降低,Bax基因表达增高(B_0组与A组比,P<0.05);再灌注后Bcl-2基因表达、bcl-2/bax的比值进一步降低,Bax基因表达进一步增高(B_4组与B_0组比,P<0.01)。应用参附注射液后,Bcl-2基因表达、bcl-2/bax的比值与对应对照组比明显增加,Bax基因表达与对照组比则明显下降(C_0组与B_0组、C_4组与B_4组比,P<0.05)。 6.HE染色光镜结果:正常的骨骼肌,肌纤维粗细均匀,排列整齐;缺血后肌纤维水肿,排列不整齐,部分溶解,并可见有少量白细胞与红细胞渗出;再灌注后肌纤维出现水肿变性、断裂甚至溶解,肌细胞严重破坏,断裂肌纤维间有大量白细胞和红细胞浸润;给药后缺血组和再灌注组骨骼肌水肿明显减轻,肌纤维变性较对照组为轻,炎性细胞浸润不明显。 7.透射电镜结果:大鼠正常腓肠肌,肌纤维排列整齐,肌细胞核结构清晰、核大、核仁明显;线粒体结构清晰。缺血后肌间隙增宽(水肿),肌丝结构紊乱,胞核缩小,染色质边集,核仁不清;线粒体肿胀,极性扩张。再灌注组肌间隙增宽,胞核结构不清,染色质浓集,核仁消失,线粒体结构不清。给药后缺血组和再灌注组与相应对照组比较肌纤维排列整齐,胞核结构清,细胞凋亡程度明显减轻;线粒体肿胀,结构破坏程度均较对照组明显减轻。 结论 1.肢体缺血再灌注后可导致骨骼肌钙超载,SOD活性下降、MDA浓度升高,血浆NO水平升高,对肢体骨骼肌具有损伤作用。 2.参附注射液能降低肢体缺血再灌注后氧自由基产生、增强SOD活性;减轻有钙超载所导致肢体缺血再灌注损伤;能够减少血浆NO的大量生成;通过增强抗凋亡基因Bcl-2的表达和减弱促进凋亡基因Bax表达抑制肢体缺血再灌注后骨骼肌细胞的凋亡,减轻肢体缺血再灌注损伤。


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