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Bordetella sp.菌株1-3顺式环氧琥珀酸水解酶的研究

李霞  
【摘要】: D(-)-酒石酸是一种非常重要的四碳手性源,在制药工业上主要用作手性拆分剂,在食品工业中,也可用作酸味剂或防腐剂。但目前尚未发现天然存在的D(-)-酒石酸,用化学拆分等方法生产D(-)-酒石酸,存在工艺复杂、成本高、对环境污染严重等缺点。由于生物转化具有高效性、高选择性、反应条件温和、对环境友好等优点,使其成为生产D(-)-酒石酸的理想替代途径。顺式环氧琥珀酸水解酶(CESH)可以水解顺式环氧琥珀酸,生成D(-)-酒石酸。但是目前关于该酶的报道较少,仅见于日本的两个专利。 本研究从土壤中分离筛选到一株可以用于生物转化生产D(-)-酒石酸的菌株,并对其进行了系统的分类学鉴定。将该菌株固定化后转化底物顺式环氧琥珀酸,成功得到了D(-)-酒石酸。随后研究了该菌株产CESH的发酵条件,对该酶进行了纯化并研究其酶性质。最后对该酶基因进行了克隆,并在大肠杆菌中进行了高效表达。主要实验结果如下: 1.菌株的筛选分离及鉴定经过富集培养划线分离纯化后,得到了一株能够生产D(-)-酒石酸的菌株,通过对该菌株的形态学研究,生理生化测定,16S rDNA测序和系统发育分析,确定菌株1-3属于博德特菌属(Bordetella sp.)。 2.固定化细胞进行生物转化的研究用凝胶包埋法固定菌株1-3的细胞,生物转化底物顺式环氧琥珀酸。将转化产物进行纯化之后,得到无色透明的晶体。用红外光谱、核磁共振和旋光测定法对晶体进行鉴定,结果显示转化产物为D(-)-酒石酸。 3.菌株产酶发酵条件的研究采用响应面的优化方法,以菌体生长量和酶活为指标,确定该菌株产CESH的最优条件。结果显示,最优培养基组成为:酵母膏7.8g/L、顺式环氧琥珀酸9.8g/L、KH_2PO_4 1.12g/L、K_2HPO_4·3H2O_3g/L、MgSO_4·7H_2O 0.625g/L、微量元素溶液12.5mL/L、pH 7.0;最适培养条件为:培养温度30℃、装液量为75mL(500mL三角烧瓶),120rpm培养30h;最终发酵液的酶活可达9.27U/mL。 4.酶的纯化和性质研究在发酵罐中培养10升菌液,离心收集,沉淀经超声波破壁后得到粗酶液。粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Cellulose离子交换层析、Toyopearl HW-65C疏水层析、Sephadex G-75分子筛层析后,纯度提高约177倍,比活达到50U/mg。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示为单一条带,分子量约为33kD。研究CESH的特性得知:该酶反应的最适pH为7.0;最适作用温度为45℃;在pH5.0~10.0、55℃以下稳定;对顺式环氧琥珀酸的Km值为10mmoL/L;Hg~(2+)、EDTA和临菲罗磷几乎使该酶完全失活;该酶活性中心有Zn~(2+)的存在。 5.顺式环氧琥珀酸水解酶基因的克隆与表达采用PCR扩增得到了菌株1-3顺式环氧琥珀酸水解酶的基因序列,并将扩增产物连接到原核表达载体pET-15b中,最后将重组质粒转入大肠杆菌进行高效表达。结果显示:大肠杆菌重组CESH的产量比野生菌的产量提高七十倍以上。对重组酶特性进行研究后发现,其pH稳定性为5.0~9.0,略窄于原始酶,其它性质无明显变化。


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