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大熊猫基因组BAC文库及Ⅱ类MHC基因组物理图谱构建

曾长军  
【摘要】: 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是我国特有的珍稀濒危野生动物。长期以来,栖息地片段化和种群数量下降,致使其野外仅分布于秦岭、岷山、邛崃、大相岭、小相岭和凉山等6个相互隔离的山系,并分化为两个独立的亚种——秦岭亚种和指名亚种。 为抢救性的保护大熊猫这一珍稀濒危物种,我国政府于2003年启动了大熊猫的离体保护工程。该工程的主要内容之一,就是通过建立大熊猫的基因组DNA文库,达到保护其遗传资源,并为相关的基础科学研究提供基因材料平台的目的。 本论文以细菌人工染色体(BAC)为载体,建立了高容量的大熊猫基因组DNA文库。进一步地,通过对大熊猫Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHC)基因组物理图谱的构建,既验证了该文库的有效性,又对文库进行了基础研究的应用,达到了立题目的。其主要研究结果如下: 1.以新鲜外周血为材料,利用pCC1BAC载体,成功构建了大熊猫的基因组细菌人工染色体(BAC)文库。文库包含的205,800个BAC克隆,保存于2,100块96孔培养板上。经对随机挑取的174个BAC克隆进行脉冲电泳检测,计算出文库的平均插入片段为97kb,覆盖大熊猫基因组约6.8倍(除去5.74%的空载体)。同时,从文库中获得任一单拷贝或多拷贝大熊猫基因的概率为99.93%。 2.16对PCR引物平均每对能够在文库中成功扩增到6.4个阳性克隆,表明了所建文库具有较高的覆盖率。 3.运用4D-PCR文库筛选技术,建立了大熊猫基因组BAC文库的高效PCR筛选文库。该文库包括43个超级库和1462(43×34)个1D、2D、3D、4D超级亚库。任一引物或探针只需77个PCR反应,即可从BAC文库中筛选到所需的阳性BAC克隆。4.以大熊猫皮肤成纤维细胞为材料,运用染色体荧光原位杂交(FISH)技术,成功地将大熊猫的MHCⅡ类基因组定位于第9号染色体的长臂上。 5.通过GenBank数据库中的同源序列,设计了10对大熊猫MHCⅡ类基因的特异性引物,并成功扩增到了大熊猫Ⅱ类MHC的BTL2、DRA、DQA、DRB1、DOB、LMP2、DMA、DMB、COL11A2和DAXX基因(基因序列已提交GenBank数据库)。 6.运用BAC克隆的末端测序方法,并利用上述10对引物,构建了大熊猫MHCⅡ类基因组的物理图谱。进一步地,利用限制性酶切指纹图谱法,证明了所构建的物理图谱中的BAC克隆是有效重叠的,其MHCⅡ类基因组的长度约为650kb。


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