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大熊猫主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类基因的研究

潘慧娟  
【摘要】: 大熊猫是我国特有的Ⅰ级濒危野生动物,被称为“国宝”,倍受世界瞩目。历史上它曾经在我国有广泛的分布,但是受冰期和人类活动的影响,大熊猫的生境越来越破碎化,到现在仅分布于秦岭、岷山、邛崃、凉山、大相岭和小相岭六个山系中,其中秦岭种群已经分化成了大熊猫的一个亚种——秦岭亚种(Ailuropoda m.qinlingensis)。 作为濒危动物离体保护的重要内容之一,我们构建了大熊猫的基因组BAC文库,以保存大熊猫的珍贵的遗传资源,同时为后面开展大熊猫的比较基因组学、基因功能研究打下基础。主要组织相容性复合体(MHC)是具有抗原呈递功能的免疫基因家族,其Ⅰ类和Ⅱ类基因具有重要的适应性意义,被应用于种群抗病能力的研究。本研究成功地分离出了三个大熊猫的MHCⅠ类基因。主要结果如下: ●以大熊猫“成功”的新鲜外周血液为材料,成功地构建了大熊猫的基因组文库,共包含205 800个克隆,保存于2100块96孔培养板上。对随机挑取的174个BAC克隆进行酶切和大小检测,计算出文库的平均插入片段为97kb,空载体率为5.74%。参照黑熊和喜马拉雅黑熊的基因组大小,本文库的基因组覆盖率为6.8倍,获得单拷贝基因的概率是99.93%。16对引物检测文库阳性克隆的数目范围为2~16,平均每对引物的阳性克隆数为6.2。 ●我们采用4D PCR的方法,从文库中筛选出目的基因。我们将文库分成43个超级库和1462(43×34)个1D、2D、3D、4D超级亚库。每对引物首先通过43个PCR反应确定阳性克隆所在的超级库,然后只需要7+7+8+12=77个PCR反应,就能从超级亚库中筛选到所需的阳性BAC克隆。 ●本研究从大熊猫mRNA和基因组BAC文库克隆了三个MHCⅠ类基因,分别定名为Aime—128、Aime—152和Aime—1906。基因结构、蛋白质结构预测、启动子分析、系统进化树分析都表明,这三个基因属于MHCⅠ类基因家族。 ●Aime—1906是大熊猫非常特殊的一个非经典的Ⅰ类基因,体现在: ⅰ.Aime—1906在外显子7的起始区域含有一个提前的终止子,使得该基因具有缩短的细胞质尾链。分析Aime—1906基因外显子2和3里面哺乳动物Ia基因都保守的十个氨基酸时,发现只有五处是保守的; ⅱ.外显子2和3的编码子第三个碱基的GC含量分布显示,Aime—1906比Aime—128和Aime—152都要低,显示出它更倾向于是Ib基因; ⅲ.外显子2和3的氨基酸变异显示,只有约1/3的氨基酸变异是位于抗原结合区域的,与经典的Ⅰ类基因情况不符; ⅳ.系统进化树分析表明,Aime—1906与DLA—79亲缘关系更近,显示出它们可能有着共同的起源关系,与大熊猫和其它食肉目动物的Ⅰ类基因处于完全隔开的进化枝上,推测该基因可能有着与其它大熊猫的Ⅰ类基因不一样的进化历史。 ●Aime—128,Aime—152是属于大熊猫Ⅰ类基因的两个位点,体现在: ⅰ.基因序列:Aime—128、Aime—152的5'UTR、3'UTR和exon 1都呈现出很大的差异性,序列相似度分别为84%、87%和88%。上游启动子序列分析表明,Aime—128、Aime—152在核心元件enhancer A和W/S都有较大的差异。比较Ia抗原结合区保守的十个氨基酸,Aime—152存在两个常规的氨基酸改变,L5和R146; ⅱ.GC含量检测:Aime—152抗原结合区域和非抗原结合区域编码子的第三个碱基的GC含量值比Aime—128要小; ⅲ.系统进化树分析:Aime—128、Aime—152在用exon2—3构建的食肉目系统进化树里面,都形成了单独的进化枝。进化关系显示,大熊猫基因组上还存在着比Aime—152更接近于Aime—128的Ⅰ类位点; ●本研究所获得的大熊猫的Ⅰ类基因外显子2和3等位基因抗原结合区域的无义突变和有义突变的置换率(ds、dn)计算都显示dn远大于ds,表明了大熊猫的Ⅰ类基因也存在着强的平衡选择; ●本研究显示,大熊猫的Ⅰ类基因与其它哺乳动物的Ⅰ类基因特征相似,是具有多个位点的复杂的基因家族。


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