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高密度培养盘基网柄菌及重组可溶性人Fas配体表达的研究

陈杰  
【摘要】: 盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum),又称为阿米巴虫是一种简单的原生动物。它的细胞个体(直径5-10μm)大于微生物,生长速率高于动物细胞,培养基中不需要添加血清,更重要的是,它们具有类似于高等动物的蛋白糖基化修饰能力。因此在作为宿主细胞表达复杂的重组药用蛋白(特别是糖蛋白)方面,有广阔的应用前景,但也存在着细胞密度及蛋白质表达水平低等问题有待于解决。 本论文通过对摇瓶和发酵罐培养条件的优化提高了盘基网柄菌培养密度,并建立了模拟细胞生长规律的生长动力学模型。进行了盘基网柄菌固定化培养研究,研制了以聚氨酯泡沫、棉纤维织物为固定化载体的固定化生物反应器。同时以可溶性人Fas配体(shFasL)作为示例蛋白,对重组表达系统进行了基因工程改造,考察了可溶性人Fas配体生产的工艺条件,并对其分离及纯化工艺进行了初步探索。 通过摇瓶培养条件的单因素优化,确定盘基网柄菌AX3-pLu8的最佳培养条件为:温度22℃,pH 6.5,摇床转速150rpm,培养时间100-120小时左右;培养基最佳碳源为葡萄糖,最佳葡萄糖浓度为15g/l。通过在HL-5C培养基中分别添加0.2g l~(-1)色氨酸和0.4g l~(-1)半胱氨酸显著提高最高细胞密度。在上述优化条件下,最高细胞密度达到了3.5×10~7ml~(-1)。在此基础上,在5L发酵罐上对分批发酵培养盘基网柄菌进行了考察,确定最优批次发酵条件为pH6.5,通气量1vvm,根据菌体生长情况分阶段改变转速,在最优条件下,菌体的对数生长期被有效地延长到了70小时,最高菌体密度达到3.7×10~7ml~(-1)。对盘基网柄菌的生长动力学进行了研究,建立了一个四参数逻辑方程生长动力学模型,完整地模拟了盘基网柄菌细胞生长直至死亡的全过程。 在摇瓶条件下,分别考察了利用聚氨酯泡沫以及棉纤维织物作为载体固定化盘基网柄菌的培养,在此研究的基础上,研制了以聚氨酯泡沫为固定化载体的旋转式生物反应器和以棉纤维织物为固定化载体的纤维床生物反应器(旋转式、外循环式)。在聚氨酯泡沫旋转式生物反应器中最高菌体密度达到了4.2×10~7ml~(-1),在旋转式纤维床生物反应器中固定化细胞密度最高达到8.2×10~7 mL~(-1),而在外循环式纤维床生物反应器中固定化细胞密度进一步提高到了1.37×10~8 mL~(-1),远高于普通悬浮培养时1~2×10~7ml~(-1)的平均细胞密度。 对原有的盘基网柄菌重组表达系统进行改造,构建了带有His-tag的重组pMB74-shFasL-H质粒载体,并转入盘基网柄菌AX3宿主菌进行表达,目的蛋白shFasL的表达量达到了157.8μg l~(-1)。而在外循环式纤维床反应器固定化培养条件下,shFasL的表达量可进一步提高到173.7μg l~(-1),在此基础上进行的重复批次发酵实现了在360小时中shFasL的持续表达,且发酵过程中细胞密度、蛋白产率均没有明显下降。对产物shFasL的分离纯化进行了初步研究,最终获得的重组蛋白的纯度可达到91.0%,回收率达到了92.1%。 此外,在攻读博士学位期间,本人还参与了国家“863”计划目标导向项目“微生物高效生产聚谷氨酸功能材料的新技术和新工艺”的部分研究工作,对原有的γ-聚谷氨酸发酵生产工艺和培养基配方进行了改进,大幅度降低了γ-聚谷氨酸发酵的氮源成本,成功地进行了100 L规模发酵罐的中师放大实验,γ-聚谷氨酸产量达到了54 g l~(-1),为工业规模生产γ-聚谷氨酸打下了坚实的基础。这部分内容单独列于本论文的附录中。


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