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天麻素和天麻苷元的体内外代谢和脑靶向性研究

王俏  
【摘要】: 天麻素(gastrodin,Gas)为名贵药材天麻(Gastrodia elata B1.)的有效单体,具有镇痛、镇静、抗惊厥、抗癫痫,增加脑血流量,保护神经细胞等功能。临床上,广泛用于神经衰弱、眩晕、头痛的治疗及癫痫的辅助治疗。最近发现,Gas对血管性痴呆有效。Gas现有肌注、静滴和口服制剂,其中注射液最为常用。 脑是Gas的作用靶器官,由于其为水溶性药物,透过血脑屏障比较困难。早期有人认为,Gas本身并无中枢作用,而是其代谢产物天麻苷元(gastrodigenin,p-hydroxybenzyl alcohol,HBA)在起作用;后来发现,Gas和HBA都对神经有保护作用,有利于记忆的巩固和恢复,具有抗氧化和清除自由基等活性。Gas注射后入脑的量比较少,临床上为达到治疗效果,给药量比较大。另外,因Gas代谢迅速,大多在2小时内排泄,为维持疗效,临床使用时需频繁给药。虽然动物毒性试验表明Gas的毒性较低,但是频繁注射给药会增加病人的痛苦,口服给药时也有恶心等胃肠道副反应。 Gas是作用于脑部而发挥药效的药物,所以对其进入脑部的量及在脑部的分布、代谢的研究尤为重要。至今,有关这方面的报道很少。为此,本工作较系统地研究了Gas的体内外代谢、脑药动学和提高其脑靶向性的给药方法,并对其代谢产物HBA的脑药动学及两者的细胞转运特性也进行了研究。 1.天麻素在大鼠脑、肝、肾及脑不同区域组织匀浆中的代谢 (1)天麻素在大鼠脑、肝、肾组织匀浆中的代谢 采用Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠的脑、肝、肾组织匀浆,研究了Gas在这些组织匀浆中的代谢特征。建立了高效液相色谱测定方法,分析柱:C18column(Diamonsil,4.6 min×250mm,5μm,Dikma);流动相:乙腈—水(2.5:97.5,v/v);流速:1.0 mL/min;检测波长:221 nm;柱温:33℃。方法对检测HBA的专属性较好,HBA在0.30—18.96μg/mL脑组织匀浆、0.30—9.48μg/mL肝组织匀浆、0.59—75.86;μg/mL肾组织匀浆的浓度范围内有良好的线性关系(n=3,r~2>0.999)。HBA在三种组织匀浆中的日内精密度均小于9.6%,日间精密度均杏?2.1%,准确度为97.5%—106.9%,脑、肝、肾组织匀浆中HBA的定量下限分别为0.290±0.045μg/mL,0.307±0.030μg/mL,0.627±00.047μg/mL(n=5)。稳定性良好。 Gas在SD雄性大鼠组织匀浆中的体外代谢研究表明,Gas的代谢产物为HBA,其在大鼠脑、肝和肾匀浆中的生成速率常数分别为0.0305、0.0121和0.1409μg/mL/min。Gas在大鼠脑、肝和肾匀浆中的清除率分别为29.7±2.1、10.4±0.8和299.5±22.7 L/min/g(×10~(-6))。Gas在脑、肝匀浆中代谢较慢,在肾匀浆中能被迅速代谢。 (2)天麻素在大鼠脑不同区域组织匀浆中的代谢 研究了Gas在大鼠脑组织不同区域(小脑、丘脑、脑桥与延脑、脑皮层、海马区、纹状体)匀浆中的代谢特征。 结果表明:Gas被代谢生成HBA的反应速度常数以小脑、脑桥与延脑、丘脑三个区比较高,皮层、纹状体、海马三个区比较低,前者为后者的约1.5倍。Gas在大鼠小脑、丘脑、皮层中的清除率分别为45.9±7.4、39.6±5.6和24.4±3.0 L/min/g(×10~(-6))。 体外实验结果表明Gas在非酶体系中稳定,在肝、肾、脑组织匀浆中Gas可被代谢为HBA,在组织中的代谢,以肾最快,脑次之,肝最小;在脑中,Gas在小脑、丘脑、脑桥与延脑区域代谢速度快于皮层、纹状体、海马区。 2.天麻素静注给药的脑药动学 建立的高效液相色谱测定方法,测定血、脑脊液时采用的流动相:乙腈—水(2.5:97.5,v/v),测定脑微透析液采用的流动相:乙腈—水(5:95,v/v)。方法对检测Gas和HBA的专属性良好。Gas在0.28-571.70μg/mL血浆,0.16-40.02μg/mL脑脊液,0.07-17.86μg/mL透析液中线性关系良好(n=5,r~2>0.999)。Gas的定量下限为血浆0.269±0.028μg/mL;脑脊液0.147±0.011μg/mL;透析液0.072±0.008μg/mL(n=6)。Gas的日内日间RSD<12.4%,血浆、脑脊液、透析液中的平均准确度分别为101.4%、96.6%、103.8%。 HBA在0.15-2.36μg/mL血浆,0.07-1.18μg/mL脑脊液,0.04-0.59μg/mL透析液中线性关系良好(n=3,r~2>0.999)。HBA的定量下限为血浆0.139±0.015μg/mL,脑脊液0.072±0.006μg/mL,透析液0.038±0.005μg/mL(n=6)。HBA的日内日间RSD<13.7%,血浆、脑脊液、透析液中的平均准确度分别为99.7%、98.8%、101.6%。稳定性良好。 SD雄性大鼠静注给予200 mg/kg Gas,尾静脉取血,延髓池取脑脊液,四个脑区进行微透析[皮层(AP:2.1;ML:2.0,DV:-0.9 mm),海马区(AP:-6.0;ML:-4.5,DV:-3.0 mm),或丘脑(AP:-3.0;ML:1.0,DV:-4.5 mm)和小脑(AP:-11.0;ML:-1.3,DV:-2.0 mm)]。微透析探针的平均回收率为0.209±0.018(流速2.5μL/min,37℃)。 大鼠Gas静注给药后,血中药物浓度下降较快,进入脑的速度也很快,但是入脑量(AUC_(brain)/AUC_(plasma))不高,脑脊液、皮层、海马、丘脑和小脑的AUC分别为血浆AUC的4.8±2.4,3.3±1.2,3.0±0.7,3.3±1.3和6.1±1.9%,小脑AUC明显高于其它三个脑区(P<0.05)。在脑和血浆中有HBA代谢生成,但量很低,浓度下降很快。 3.天麻素十二指肠给药的脑药动学 SD雄性大鼠在十二指肠给予200 mg/kg Gas,收集血、脑脊液和脑微透析液。微透析探针的平均回收率为0.233±0.021(流速2.0μL/min,37℃)。 Gas十二指肠给药后,血T_(max)与脑脊液T_(max)相似,分别为55.6和57.5 min,四个脑区以小脑中C_(max)最高(5.3±1.2μg/mL),AUC最大(491.2±220.6 minμg/mL)。脑脊液、皮层、海马、丘脑和小脑的AUC分别为血浆AUC的4.9±1.2,2.4±1.0,2.5±0.8,2.6±0.8和4.7±2.2%。Gas小脑的AUC明显高于其它三个脑区(P<0.05),与静注相似。脑和血浆中代谢生成的HBA量也很低。Gas血浆的绝对生物利用度为55.0%。相同剂量给药,口服Gas后代谢产生的HBA要比静注稍多,血中HBA的AUC为静注的1.4倍(但无显著性差异,P>0.05),而脑脊液AUC约为静注2.3倍(P<0.01)。结果显示Gas十二指肠给药后,其药动学特性与静注相似。 4.天麻素静注与鼻腔给药的药动学比较 建立的高效液相色谱测定方法,对检测在脑脊液和血样中的Gas有较好的专属性,Gas在0.16-9.98μg/mL脑脊液,0.39-99.85μg/mL血浆范围线性关系良好(n=5,r~2>0.999)。日内日间RSD<6.4%,平均准确度脑脊液和血浆分别为100.4、100.6%。定量下限为脑脊液0.148±0.008μg/mL,血浆0.397±0.020μg/mL(n=6)。稳定性良好。 SD雄性大鼠鼻腔或静注给予50 mg/kg Gas。 Gas鼻腔给药与相同剂量的静注比较,鼻腔给药后进入血中的量比较低,而相应地进入脑脊液中的量比较高,脑脊液中Gas的AUC与静注的相似。鼻腔给药的血浆AUC与静注AUC的比值为8.8%,而脑脊液AUC与静注AUC比值为105.5%,从而可使脑靶向指数达12.3。提示,通过鼻腔给药可提高Gas的脑靶向性。 5.天麻苷元与天麻素静注给药的药动学比较 建立的高效液相色谱测定方法,对于检测脑脊液中HBA的流动相:乙腈—水(4:96,v/v);对于检测血中HBA的流动相:乙腈—水(3:97,v/v)。方法对检测脑脊液和血浆中的HBA有较好的专属性,HBA在0.07-37.73μg/mL脑脊液,0.23-30.34μg/mL血浆范围内线性关系良好(n=3,r~2>0.999)。定量下限为脑脊液0.074±0.007μg/mL,血浆0.258±0.016μg/mL(n=5)。脑脊液、血浆中的日内日间RSD<9.4%,平均准确度分别为100.5%、105.5%。稳定性良好。 SD雄性大鼠静注给予50 mg/kg HBA。Gas静注给药(50 mg/kg)同第4部分内容。 研究了HBA直接静注后的药动学,结果表明HBA血和脑脊液中的t_(1/2)分别为9.2±1.7和12.4±3.1min,明显短于Gas,表明HBA的消除比Gas更快。脑脊液中HBA的C_(max)和AUC高于血浆。 6.天麻苷元静注与鼻腔给药的药动学比较 SD雄性大鼠鼻腔或静注给予10 mg/kg HBA。 HBA同剂量鼻腔给药与静注给药相比,都表现出脑脊液中AUC和C_(max)高于血浆的特点。两种途径给药,HBA都可迅速进入脑脊液,鼻腔给药的脑脊液或血浆AUC与静注的比较无显著性差异。提示,HBA鼻腔给药后能快速完全地进入体循环,再透过血脑屏障,鼻腔给药可望替代静注给药。 7.天麻素和天麻苷元在Caco-2、MDCK-MDR1和MDCK细胞的转运研究 采用Caco-2细胞、MDCK-MDR1和MDCK细胞进行Gas和HBA的转运研究。 Gas和HBA在Caco-2细胞转运研究结果表明Gas口服吸收利用度可能不高,这与其自身脂溶性较差有关;而HBA的吸收较好。Gas和HBA在MDCK-MDR1和MDCK细胞转运研究结果表明Gas较难透过,Gas的R值小于2,不是P-gp的底物;HBA易透过,R值也小于2,对Rho123的外排也无显著影响,不是P-gp的底物,也不是P-gp的抑制剂。两个细胞转运试验结果表明,Gas的跨膜转运较差,不是P-gp底物,可能存在非P-pg介导的外排。HBA的跨膜转运好,也不是P-gp底物或抑制剂,低浓度时有较弱的非P-pg介导的外排机制存在,这种外排机制可为高浓度的HBA逆转。


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