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浙江汉族人群ABO血型等位基因多态性的研究

祝宏  
【摘要】: 研究背景 ABO血型系统是人类最先发现的重要血型系统,在输血医学和器官移植等方面具有重要意义。经典的血型血清学方法按照抗原的不同可分为A、B、O、AB四种表型,此外ABO血型系统也存在一定的亚型(弱A或弱B)。上世纪九十年代明确了ABO血型基因的核苷酸序列、结构以及一些常见突变点。ABO基因位于染色体9q341-34.2,包含长度大小从28-688bp不等的7个外显子。现一般将A101作为参考序列,B101有7个核苷酸与A101基因不同,导致蛋白上四个氨基酸变化,其中两处替换(L266M和G268A)决定酶的特性。常见的O等位基因上为第6外显子第261位单核苷酸缺失,造成酶活力的丧失。此外也发现少量的261位未缺失的O等位基因。随着分子技术不断完善,现ABO血型基因分型的方法有PCR-RFLP、PCR-SSP、PCR-SSCP、PCR-SSO、PCR-SBT和PCR-GeneScan等,其中最佳的方法是PCR-SBT。到目前为止,通过分子生物学方法已鉴定200多个ABO等位基因。 本研究的目的在于建立ABO血型基因诊断的测序方法(PCRSBT),获取浙江汉族人群ABO血型基因多态性的分布资料,并分析献血人群ABO亚型和不规则抗体分布情况,为临床输血提供更好的技术指导和帮助。实验使用PCR-SBT方法对ABO基因第6、7外显子进行了测序分析,并检测了部分浙江汉族人群标本,发现了三个新的等位基因。 实验方法 1、标本来源 1.1 ABO血型表型分析:2008年7-9月来浙江省血液中心的随机无偿献血者30519名,通过填写征询表确认其民族为汉族。 1.2人群中ABO亚型和不规则抗体调查:2008年来浙江省血液中心的随机无偿献血者,共计标本数为167888人次。 1.3 ABO血型等位基因分布情况:标本来自2008年7-9月浙江省血液中心的随机无偿献血者。所有标本经其知情同意后采集5ml EDTA抗凝血,分别吸取1-2ml血样贮存在-20℃以下备用。标本总数为417例。 2、血清学方法测定 2.1 ABO表型检测:采用PK7200全自动血型检测系统测定ABO血清学表型,参照仪器说明书进行操作。 2.2 ABO亚型鉴定:对于正反定型不一致或者疑是亚型的标本进行鉴定,采用试管法,具体参照中心参比实验有关操作说明进行。 2.3不规则抗体鉴定采用凝集技术在PK7200自动血型检测系统检测。 3、标本DNA提取:采用QIAamp Blood Kit商用抽提试剂盒。 4、ABO基因第6-7外显子测序分析 4.1 PCR扩增:PCR扩增引物序列参照ABO基因序列,采用一对引物对进行5-7外显子扩增,PCR引物序列和扩增条件参照正文,扩增反应体系总体积为25μl。 4.2 PCR产物纯化:每孔中加入核酸外切酶Ⅰ1μl(5U),虾碱性磷酸酶2μl(2U),ABI公司的9700型PCR自动扩增仪进行酶切反应,37℃60min,80℃15min。 4.3测序反应:分别针对外显子6、7设计四个测序引物,以纯化PCR产物为模板按BigDye Sequencing kit(ABI公司)试剂盒操作进行测序反应,ABI公司9700型PCR自动扩增仪扩增,扩增条件为95℃预变性5min,95℃10s,50℃10s,60℃4min,25个循环,冷却至4℃。 4.4测序反应纯化和电泳分析:采用乙醇/醋酸钠法纯化,然后在ABI 3730测序仪上进行测序电泳分析。 4.5测序结果分析和判断:SeqScape V2.5软件进行数据分析。 5磁珠M-270链亲和素方法分离新等位基因的单倍体 当鉴定的新等位基因为杂合子,采用磁珠M-270链亲和素方法(Invitrogen,Wisconsin,USA)分离其单倍体。主要分两步,第一步模板DNA与5′端生物素标记特异性探针反应,生物素探针只与特定的DNA单链结合。第二步将生物素标记单链DNA加入链亲和素化磁珠M-270形成生物素标记DNA-链亲和素包被磁珠,经洗涤、磁选后得到的DNA单链可作为ABO基因外显子6-7的扩增模板。 6、统计学分析:人群基因频率(gene frequency,GF)采用直接计数法计算,即检测出的基因个数/2N(N=标本数)。Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验采用x~2检验。p<0.05表示具有统计学意义。 结果 1、30519例浙江汉族人群ABO血型表型分布情况 采用凝集方法,结果显示A型为9274例,占30.4%。B型为7986例,占26.2%。O型为10542例,占34.5%。AB型为2717例,占8.9%。ABO血型表型分布中O>A>B>AB。 2、ABO亚型与不规则抗体检测情况 从167888例标本中检出8例ABO亚型,ABO亚型频率为4.8/10万。检出43例不规则抗体,不规则抗体检出频率为2.6/万。其中抗M为32例,占74.4%。抗D为4例,占9.3%。冷凝集为3例,占7.0%。抗H、抗C、抗P1、自身抗体各为1例。抗M为最常见的不规则抗体。 3、浙江汉族人群ABO等位基因型分布情况 结果显示外显子6、7序列确定的ABO基因型与表型完全相符。在浙江汉族人群中共发现27种基因型,频率大于1%的为11种。常见的基因型分布为A102/O01为54例(12.95%),A102/O02为34例(8.15%),A102/A102为19例(4.56%);B101/O01为56例(13.43%),B101/O02为38例(9.11%),B101/B101为20例(4.80%),O01/O02为70例(16.78%),O01/O01为44例(10.55%),O02/O02为19例(4.56%),A102/B101为33例(7.91%)、人群中基因型为纯合子的为102例(24.46%),杂合子为315例(75.54%)。 4、浙江汉族人群ABO等位基因分布情况 412例标本中共检测到14个ABO等位基因,包括五个常见的等位基因:A101、A102、B101、O01和O02。此外有6个较少见的等位基因:A205、B110、O04、O05、O07、O50,还有3个新的等位基因:B112、B526C和O743C。频率大于1%的为A101(1.56%)、A102(19.78%)、B101(20.62%)、O01(33.69%)和O02(22.30%)。人群中最常见的等位基因为O01,在A基因中共发现3个等位基因A101、A102、A205,A102频率大于A101,A205发现有2例占0.240%。在B基因中共发现4个等位基因B101,B110、B112、B526C。在O基因中共发现7个等位基因O01、O02、O04、O05、O07、O50、O743C。 5、3个新等位基因情况 在417例标本中发现3个新的等位基因,三个新等位基因的DNA序列已提交GenBank(序列号为FJ599810、FJ638611和FJ851690)。这三个突变点都发生在外显子7区域。 5.1 B112(559T):在一个B/O杂合子个体中发现该等位基因(B112/O01),DNA磁珠纯化技术分离得到单倍体,测序发现在B型单链上存在突变。B112与B101比较在第559位C>T,导致一个氨基酸改变(Arg187Cys),血清学上未观察到血清学特性的变化。 5.2 B526C:在一个AB个体中发现(A102/B526C),通过磁珠纯化获取单链,结果发现B等位基因在526位G>C,导致一个氨基酸改变。526位是A和B基因间的差异碱基,在该处A型是C、B型是G。该标本未观察到任何血清学特性变化。 5.3 0743C:在3个标本中发现存在0743C等位基因,其中两个O型杂合子(O01/0743C)和一个B型杂合子(B101/0743C)。与O01序列比较,0743C发生一个突变743G>C,由于与O01相同存在261位G缺失,在第261位以后发生阅读框架的移动,形成新的终止密码子,提前终止了转移酶的翻译。 结论 1、获取了浙江汉族人群ABO血型表型分布情况。 2、获取了浙江汉族人群ABO亚型与不规则抗体分布情况。 3、首次获取了浙江汉族人群ABO血型等位基因多态性数据。 4、发现了三个新的等位基因。


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