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家蚕杆状病毒vp80, Bm21及家蚕SUMO基因研究

唐旭东  
【摘要】: 家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucloepolyhedrivirus,BmNPV)是杆状病毒的模式病毒之一,它的基因组全长128413bp,编码136个ORF,本文选择了一个BV和ODV都含有的结构蛋白基因Bmvp80基因,一个Group 1型杆状病毒特有的基因BmNPV ORF21基因进行了研究。同时研究了家蚕的一种新的修饰蛋白SUMO(small ubiquitin-like modifier)及其对BmNPV在BmN细胞中复制的影响。主要结论如下: 1、BmVP80功能研究 在大肠杆菌中表达了BmVP80部分片段,制备了多克隆抗体,免疫荧光定位发现BmVP80在细胞核内表达,利用ET重组系统构建了BmVP80敲除的BmBacmid,敲除后的病毒不能产生有侵染能力的BV,将完整的BmVP80异位补回后,敲除的病毒恢复了感染能力。透射电镜发现BmVP80敲除后核衣壳的数量明显下降。为了研究Bmvp80是否具有种属特异性,用在不同启动子启动下的Acvp80拯救BmVP80敲除的BmBacmid都告失败,表明Bmvp80有种属特异性。总的来说Bmvp80是BV产生和核衣壳成熟必需的,并且具有种属特异性。 2、BmNPV ORF21(Bm21)部分功能研究 Bm21是鳞翅目昆虫NPV特有的基因,在本实验中克隆和表达了该基因,RT-PCR分析了Bm21的转录时相,发现在12 h.i.开始转录,在BmN细胞中利用Bac-to-Bac表达系统间接定位发现Bm21表达产物在细胞核和细胞质中都有分布。利用ET系统构建了Bm21部分敲除的缺失病毒,转染细胞没有发现明显的细胞病变,表明Bm21的敲除影响了病毒的复制。 3、家蚕SUMO基因研究 BmSUMO编码一个含91个氨基酸的蛋白,序列分析发现它与SUMO2/3同源性较高(67%),而与SUMO1只有51.7%的同源性。免疫荧光定位发现BmSUMO在整个细胞中都有分布,并且在细胞核内呈点状分布。Western blot实验表明在家蚕细胞内有许多蛋白是被SUMO修饰的。在极早期启动子IE-1启动下过量表达SUMO发现过量表达抑制了病毒感染后48小时内病毒的复制,在48小时后病毒的滴度恢复到了野生型水平。


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