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乳酸链球菌素耐药菌株的筛选和耐药机理研究

朱洁  
【摘要】: 乳酸链球菌素Nisin是由部分Lactococcus lactis(乳酸链球菌)菌株产生的一种细菌素,可抑制多种革兰氏阳性细菌,对人体安全无毒,在食品行业已经应用了50多年,目前尚未见应用中的耐药菌株报道。随着Nisin应用的快速增加和普及,Nisin也许也会象抗生素一样在自然界中产生相应的耐药性菌株,从而影响和限制Nisin的使用。本研究从浙江杭州自然界及应用Nisin为防腐剂的食品样品中尝试分离Nisin的耐药性菌株,分析在自然界或实际应用环境中Nisin耐药菌株产生的原因,并对耐药菌株的耐药机理进行探讨。 主要研究结果如下: 1.乳酸链球菌素耐药菌株的分离筛选和鉴定 从杭州十个不同市场采集的土壤、植物叶片及食品样品中,分离共获得102个革兰氏阳性细菌菌株,以不同浓度的Nisin筛选,50 IU Nisin抑制其中47个菌株,占所有菌株的49.0%;100 IU Nisin抑制61个菌株(59.8%);200 IUNisin抑制84个菌株(82.4%);500 IU Nisin抑制97个菌株(95.1%);剩下5个菌株(NIS06、NIS13、NIS17、NIS41、NIS98)为Nisin高度耐药菌株,500 IU Nisin不能抑制其生长。最小抑菌浓度(MIC)测定发现NIS41菌株对Nisin的MIC达2560IU,NIS13、NIS17、NIS98 3个菌株的MIC为1280IU,NIS06菌株的MIC为640IU。通过生理生化方法及16S rDNA序列分析5个细菌均鉴定为葡萄球菌属,其中NIS41为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis),NIS06,NIS13,NIS98为松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri),NIS17为木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus) 2.5个Nisin耐药菌株的耐药性分析 分离自自然界及市场样品的5个Nisin耐药菌株S.epidermidis NIS 41、S.sciuri NIS06、S.sciuri NIS13、S.sciuri NIS98、S.xylosus NIS17在无Nisin的培养基中连续转接30个世代后,对Nisin的耐药性没有发生显著改变,说明这5个Nisin耐药菌株的耐药性具有较好的遗传稳定性。用碱裂解法提取,5个菌株均没有发现质粒;以这5个菌株的基因组DNA为模板,以NisI/NisFEG部分序列为引物的聚合酶链式反应法(PCR)未能扩增到NisI/NisFEG疑似基因,说明上述菌株不存在类似乳酸链球菌的相关免疫基因。以LB液体培养基、黄色微球菌的去菌液为对照,5个耐药菌株的培养去菌液37℃分别处理Nisin8h,与对照相比,Nisin活性明显降低,表明这5个耐药菌株的去菌液中存在着Nisin失活物质,这可能是其主要的耐药机制。 3.耐药菌株S.epidermidis NIS 41 Nisin失活物质(NIS)研究Nisin失活物质(NIS)在Nisin耐药菌株Staphylococcus epidermidis NIS 41的生长稳定期开始大量产生。培养液中的NIS在80%饱和度硫酸铵浓度下无法沉淀。37℃、60℃处理20分钟对NIS活力无明显影响,80℃以上处理活力下降。NIS在pH4~10内具有活性,最适pH值在8.0左右。NIS 4℃下保存8天以内活力基本稳定,8天以后活力开始下降,15天左右活力完全丧失。二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、无水乙醚无法从水中萃取NIS,乙醇、丙酮、甲醇无法沉淀NIS。30℃真空条件下NIS可挥发。NIS对Nisin具有抑制作用,但对地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZJU12产生的细菌素无抑制。Tricine-SDS-PAGE检测发现NIS对Nisin具有降解作用,但用NIS处理BSA没有观察到降解现象。NIS的初提液经过冻融分管浓缩,高效液相色谱HPLC分离后,电喷雾质谱(ESI-MS)分析得到NIS的分子量174.9 4.Nisin的商业产品的纯化及对其抑菌作用的影响 Nisin的商业产品经过CM-32离子交换色谱,1Kda的透析袋透析脱盐浓缩,并以Tricine-SDS-PAGE检测纯度,获得Nisin纯品。检测Nisin粗品和Nisin纯品对黄色微球菌M.flavus NCIB 8166,表皮葡萄球菌S.epidermidis NIS 41,大肠杆菌Escherichia coli BL21,乳酸链球菌Lactococcus lactis LY3的最小抑菌浓度,Nisin粗品和纯品对M.flavus NCIB 8166的MIC为50IU;对Nisin耐药菌株S.epidermidis NIS 41的MIC都是3200IU;25600IU的Nisin纯品与Nisin粗品都无法抑制E.coli BL21和L.lactis LY3,说明Nisin纯品与Nisin粗品对这四个菌株的抑菌活性没有显著差异,纯化作用对Nisin的抑菌并没有影响。平板计数琼脂法检测NaCl对Nisin抑菌作用的影响,发现0mM,50mM,100mM NaCl浓度条件下,Nisin粗品与Nisin纯品对4个菌株的抑菌曲线均保持相对平稳,没有明显的变化,说明在小于100mM NaCl浓度条件下NaCl对Nisin的抑菌作用没有明显影响。


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