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果蝇碱性神经酰胺酶(DaCER)特征化及其在发育、存活和繁殖中的作用

杨琼  
【摘要】: 神经酰胺酶能够水解神经酰胺生成鞘氨醇和脂肪酸。这些鞘脂质的代谢与多种生物(从酵母到哺乳动物)的细胞反应相关。通过本研究我们证明了果蝇BWA基因所编码的蛋白具有碱性神经酰胺酶的活性,并且这个蛋白在果蝇的鞘脂质代谢、发育、存活和繁殖中发挥重要的作用。以下是本研究获得的主要结果: 1.用人类神经酰胺酶作为关键词在果蝇基因组数据库中进行Blast搜索,我们发现了一个由果蝇洗脑基因(brain washing,BWA)编码的蛋白与人类神经酰胺酶1(ACER1)、人类神经酰胺酶2(ACER2)和人类神经酰胺酶3(ACER3)的蛋白序列分别具有35%、46%和26%的同源性。运用RT-PCR的方法我们克隆得到了BWA基因的全长cDNA。通过比对还发现,BWA编码的蛋白与其它的碱性神经酰胺酶也具有相同的氨基酸保守区域。用pSORTII软件可以预测到BWA的蛋白产物含有5个假定的跨膜区域,推测BWA编码的蛋白是多跨膜区域神经酰胺酶超家族中的一员。 2.在Tn细胞中过量表达BWA基因能够在pH 8.0、C24:1-ceramide作底物的条件下增加神经酰胺酶的活性,这说明BWA编码的蛋白具有神经酰胺酶的活性,因此我们将BWA重新命名为果蝇碱性神经酰胺酶(DaCER)。DaCER酶反应最适温度是35℃。我们还发现DaCER酶反应具有更广的pH范围,其中最佳pH值是8.0。 3.实时定量PCR的分析结果显示,DaCER的mRNA在果蝇卵巢中表达量最高,脑部和中肠其次,在其它部位只有少量的表达。DaCER在果蝇发育过程中蛹期的表达量上调。我们构建表达载体pEGFP-C1-DaCER,并将它转染HeLa细胞。荧光显微镜观察的结果显示,DaCER分布在细胞的质膜和高尔基复合体上。 4.DaCER的功能失活导致果蝇未成熟期的发育延迟但是寿命和生殖力却显著提高,说明DaCER在果蝇的发育、寿命和繁殖中起重要的作用。 5.由转座子插入造成的DaCER功能的失活导致果蝇体内鞘氨醇和二氢鞘氨醇的水平下降,特别是C_(16)鞘氨醇的水平显著减少。这与MAPP处理的体外实验的结果相一致。经过MAPP 72h处理的S2细胞内的C_(16)鞘氨醇的水平也显著的降低,表明DaCER功能的失活对鞘脂质的代谢有改变作用。 6.为了深入研究DaCER表达的下调在体外水平上对细胞的影响,用RNAi的方法将S2细胞中DaCER的表达量下调。实时定量PCR分析结果显示,转染了DaCER特异的双链RNA的S2细胞中,DaCER的mRNA水平显著降低,但是中性神经酰胺酶的表达有少量升高。流式细胞仪对DaCER下调后的S2细胞的细胞周期分析结果则显示DaCER表达量减少后,S期细胞所占的百分比与对照性比没有显著的差别。 总之,碱性神经酰胺酶DaCER在果蝇的鞘脂质代谢、发育、存活和繁殖中发挥重要的作用。


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