天敌对稻飞虱捕食作用的评价方法研究

【摘要】： 褐飞虱Nilaparvata lugens、灰飞虱Laodelphax striatellus和白背飞虱Sogatellafurcifera，属同翅目飞虱科(Homoptera：Delphacidae)，是我国水稻上的最重要害虫；稻田生态系统中，捕食性天敌的种类和数量非常丰富，在控制稻飞虱为害方面起着重要的作用；明确捕食性天敌种类以及各种捕食性天敌对稻飞虱控制作用的大小是充分发挥天敌控制作用的基础和前题。本研究通过PCR克隆得到白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱的ITS基因序列，设计合成了三种飞虱的引物和特异性ALLGlo探针，建立优化了ALLGlo探针三重实时荧光定量检测体系和方法，并应用该方法对稻田常见捕食性天敌对稻飞虱的捕食作用进行了研究。获得的主要结果如下： 1．利用PCR方法克隆了白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱的线粒体细胞色素氧化酶亚基(COI)基因和内部转录间隔区域(ITS1和ITS2)基因，三种飞虱的COI，ITS1和ITS2基因序列分析表明：COI，ITS1和ITS2在白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱种间的相似性分别为89.02％，67.98％和70.11％。 2．利用白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱的ITS2基因序列，设计合成了一对这三种飞虱特有的引物，该引物不与稻田其它主要害虫、天敌和中性昆虫基因组DNA发生扩增作用，具有这三种稻飞虱的特异性；该引物对白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱基因组DNA的扩增片段长度分别为192，215和207bp；利用该引物建立了多重PCR体系，该体系可定性检测捕食性天敌消化道内残留的飞虱基因组DNA。 3．根据ALLGlo探针设计原则，选取白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱的ITS2基因序列，利用Primer Express 2.0软件，设计合成了白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱引物和特异性ALLGlo探针；通过调整引物、探针、dNTP和酶浓度，建立优化了三重实时荧光定量检测体系。该体系仅与这三种稻飞虱发生反应，具有高度的特异性，该三重实时荧光检测体系对白背飞虱标准质粒的灵敏度为100个拷贝，标准曲线为y=-3.8251gx+45.391，R~2=0.99，扩增效率为182.57％，动态范围为10~2～10~7；褐飞虱标准质粒的灵敏度为1000个拷贝，标准曲线为y=-3.7821gx+43.786，R~2=0.98，扩增效率为183.82％，动态范围为10~3～10~7；灰飞虱标准质粒的灵敏度为100个拷贝，标准曲线为y=-3.6481gx+42.898，R~2=0.99，扩增效率为187.98％，动态范围为10~2～10~7。干扰实验证明，将不同模板按不同浓度组合，当两种飞虱模板浓度即使相差10000倍时，低浓度的质粒DNA仍然能够检测到，并且具有很高的相关性，决定系数R~2达到0.99以上；同时，捕食者基因组DNA对猎物DNA的多重实时定量PCR不存在抑制作用或降低扩增效率。 4．定量检测结果表明单头白背飞虱长翅雌虫目标拷贝数为111192839，标准差为8873990，变异系数为7.98％；单头褐飞虱长翅雌虫目标拷贝数为860074796，标准差44151965，变异系数为5.13％；单头灰飞虱长翅雌虫目标拷贝数为274680423，标准差为8690453，变异系数为3.16％。添加回收实验表明CTAB裂解法提取基因组DNA过程中目标拷贝的平均损失率为10.66％，因此可以用CTAB法提取捕食者消化道内残留的微量猎物基因组DNA。单头白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱长翅型雌性成虫在拟环纹豹蛛消化道内的降解曲线分别为：白背飞虱，y=0.548x+21.594，决定系数R~2=0.8744，经28h消化后，残留约1580个拷贝；褐飞虱y=0.2075x+22.257，决定系数R~2=0.5047，经32h消化后，残留约23870个拷贝；灰飞虱，y=0.5304x+20.588，决定系数R~2=0.8125，经24h消化后，残留约2710个拷贝。 5．应用多重实时荧光定量PCR研究了嘉兴单季晚稻田主要捕食性天敌对白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱的捕食作用。结果表明，在稻田生态系统中，白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱有多种共同的捕食性天敌，不同捕食者对不同猎物的阳性反应率不同。就白背飞虱而言，八斑球腹蛛阳性率最高达73.64％，最低的黑肩绿盲蝽也达到34.94％；对褐飞虱而言，黑肩绿盲蝽阳性率最高达72.06％，最低的为锥腹肖蛸仅有12.71％；对灰飞虱而言，拟环纹豹蛛阳性率最高达79.14％，最低的为锥腹肖蛸也达到44.92％。 6．不同捕食者对三种稻飞虱猎物留量存在很大差异。在整个水稻生长期内，就白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱来说，都是拟环纹豹蛛消化道内猎物平均残留最高，分别为53600拷贝，13587277拷贝和3829821拷贝。对白背飞虱黑肩绿盲蝽平均残留拷贝数最少，为5214拷贝；对褐飞虱食虫瘤胸蛛平均残留拷贝数最少，为500151拷贝；对灰飞虱锥腹肖蛸平均残留拷贝数最少，为32957拷贝。 7．对三个不同调查时间的捕食性天敌消化道内飞虱残留种类、构成进行分析。对于灰飞虱和白背飞虱在7月上前后迁入，褐飞虱在7月下～8月上迁入的迟栽单季晚稻，分蘖末期(8月14日)时拟环纹豹蛛、八斑球腹蛛和食虫瘤胸蛛主要以白背飞虱和灰飞虱为主，并且有相当高比例的捕食者消化道内一种飞虱都没有；抽穗期(9月14日)和灌浆期(10月10日)时拟环纹豹蛛、八斑球腹蛛、食虫瘤胸蛛和黑肩绿盲蝽消化道内的猎物种类多样性增加，褐飞虱和灰飞虱成为主要猎物，阳性率最高达100％。同时，消化道内三种飞虱残留都存在的比例也大幅增加，甚至达到80％。结果表明，拟环纹豹蛛、八斑球腹蛛、食虫瘤胸蛛和黑肩绿盲蝽对褐飞虱和灰飞虱的捕食主要受两种飞虱种群数量的影响，随着两种飞虱种群数量的增加，拟环纹豹蛛、八斑球腹蛛、食虫瘤胸蛛和黑肩绿盲蝽的猎物种类和构成都相应增加。 8．比较同一时期和不同时期，不同捕食者对白背飞虱、褐飞虱和灰飞虱捕食作用残留量可知：从9月上旬到10月下旬，拟环纹豹蛛、八斑球腹蛛、食虫瘤胸蛛和黑肩绿盲蝽消化道内残留褐飞虱都较高；从8月上旬到9月中旬，拟环纹豹蛛和八斑球腹蛛消化道内残留灰飞虱较高，9月中旬后，拟环纹豹蛛、八斑球腹蛛、食虫瘤胸蛛和黑肩绿盲蝽消化道内残留灰飞虱也较高；对白背飞虱而言，整个水稻生长期，这几种捕食者消化道的残留都很低。捕食者猎物残留量的变化与稻田白背飞虱种群一致较低和褐飞虱、灰飞虱种群9月份才上升的动态是一致的。