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绿木霉(TRICHODERMA VIRENS)TY009菌株胶霉毒毒素分离纯化及绿色荧光蛋白标记研究

刘路宁  
【摘要】: 本实验室在前期工作中发现绿木霉(Trichoderma virens)TY009菌株的次生代谢物中有一个组分具有抑制水稻纹枯病菌菌丝生长的生物活性。本文对T.virens菌株TY009代谢物的活性组分进行分离、纯化和鉴定,明确了该活性物质对立枯丝核菌的菌丝生长及对菌核萌发的抑制作用;同时构建了一个可以在木霉中表达绿色荧光蛋白GFP基因的质粒载体,通过遗传转化,对T.virens菌株TY009进行绿色荧光蛋白标记,并利用标记菌株观察了绿木霉对水稻纹枯菌菌核的定殖。试图评价绿木霉(Trichoderma virens)TY009菌株防治水稻纹枯病的潜力。 主要研究结果: 1绿木霉TY009菌株胶毒素的分离、纯化和鉴定及其对水稻纹枯病菌的抑制作用 通过乙酸乙酯萃取,色谱柱分离、薄层层析分离得到纯化的活性组分,经质谱分析,木霉代谢物中的一个活性组分的结构初步鉴定为胶霉毒素,其分子量为326道尔顿。提纯的胶霉毒素在100℃条件下,加热60 min仍对纹枯菌病菌的生长有抑制作用。胶霉毒素对水稻纹枯病菌的抑制作用在酸性条件下得到增强,在碱性条件下减弱。 胶霉毒素对水稻纹枯病菌有显著的抑制作用,当其浓度为80μg/ml时完全抑制了其菌丝生长;胶霉毒素在浓度160μg/ml时菌核的萌发率为0.00%,40μg/ml时菌核的萌发率为71.67%,对照萌发率为100%。 2绿木霉TY009菌株绿色荧光蛋白标记 构建了带有绿色荧光蛋白基因gfp片段的适于真菌的表达载体pSilent-EGFP,通过PEG-CaCl_2介导的原生质体法导入绿木霉TY009菌株,得到稳定的转化子。转化效率是3~4转化子/μgDNA。PCR及荧光检测可知,构建的载体己将绿色荧光蛋白基因导入木霉的基因组,并且得到表达。 gfp转化子菌株的不同生长阶段荧光表达有差异,与木霉在不同阶段细胞活力有关:幼嫩菌丝的细胞活力强,荧光表达强烈,而老熟菌丝细胞活力差,荧光表达弱,在老熟菌丝中,细胞质浓缩部位有荧光反应,而无细胞质的中空部位没有荧光反应。厚垣孢子在还未成熟时(尚与菌丝连接)荧光表达强,成熟后的厚垣孢子荧光表达相对减弱。 gfp转化子生物学特性测定显示,在产孢量上与野生型菌株没有差异,在生长速度上转化子菌株比野生型菌株TY009慢并且差异显著,转化子之间有的也存在显著差异。对绿色荧光蛋白标记的木霉菌株检测分析后发现,gfp转化子的生防特性与野生型菌株相比没有差异。3个强荧光表达突变子产生的代谢物的粗提物的成分在种类上与绿木霉菌株TY009所产生的代谢物的粗提物的成分是相同的。 3绿色荧光蛋白标记绿木霉菌株对水稻纹枯病菌菌核的定殖 利用强荧光表达转化子观察木霉对纹枯病菌菌核的定殖,在菌核和木霉接触2 d后,菌核表面形成了木霉菌丝包被;5 d后木霉菌丝进入菌核的浅表部位;20d进入菌核的部位加深;40 d后整个菌核包括菌核的中心部位都有荧光出现,菌丝穿透拟薄壁组织,菌核变软。在菌核内部存在大量厚垣孢子,厚垣孢子萌发产生菌丝,菌丝主要沿着菌核拟薄壁组织细胞壁扩展。 上述研究结果为阐明绿木霉(Trichoderma virens)TY009菌株的生防机制及其进一步开发利用奠定了基础。


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