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重组产气肠杆菌提高产氢效率的研究

赵锦芳  
【摘要】: 随着环保要求的迫切和化石能源的日益短缺,氢能作为清洁高效的可再生能源受到人们的普遍重视。目前通过基因工程和代谢调控手段改造产氢生物,是生物制氢领域的研究热点。本文以高效产氢细菌产气肠杆菌Enterobacter aerogenesATCC13408为主要研究对象,对其产氢代谢途径中的相关基因进行了以下研究: 克隆阴沟肠杆菌E.cloacaeⅡT-BT 08的铁氢酶hydA基因,并在大肠杆菌E.coli BL21、产气肠杆菌E.aerogenes ATCC13408和阴沟肠杆菌E.cloacaeCICC10017中实现异源表达,重组后细菌的产氢量均有不同程度的提高:使原本不产氢的E.coli BL21氢气产量达到0.5mol H_2/mol葡萄糖,使产气肠杆菌的氢气产量从原菌的1.19 mol H_2/mol葡萄糖提高到2.31 mol H_2/mol葡萄糖,使阴沟肠杆菌的氢气产量从原菌的1.286 H_2/mol葡萄糖提高到2.545 mol H_2/mol葡萄糖。 fhlA基因是产气肠杆菌甲酸-氢裂解酶系统FHL的转录激活蛋白,本文通过设计简并性引物和genomic walking技术,成功克隆了fhlA基因,完整的ORF全长2073 bp,编码690个氨基酸。FhlA成功地在产气肠杆菌中实现过量表达,重组后的细菌的产氢能力由原菌的1.23 mol H_2/mol葡萄糖提高到了1.48 molH_2/mol葡萄糖,提高了20.36%。 产气肠杆菌氢酶属于典型的[NiFe]氢酶,由多亚基共同组成。本文扩增出E.aerogenes ATCC13408的hyc操纵子全长,共有9个亚基的ORF,其中HycE、HycG分别编码氢酶的大、小亚基,hycE和hycG基因的过量表达使产气肠杆菌的底物产氢潜力由1.14 mol H_2/mol葡萄糖提高到了2.05 mol H_2/mol葡萄糖和2.08 mol H_2/mol葡萄糖,分别提高了80.1%和82.65%。 蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803的hoxEFUYH基因全长6493 bp,由E、F、U、Y、H共5个亚基组成一个NAD-还原型氢酶操纵子。本文克隆了蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803的hoxEFUYH氢酶基因,并在产气肠杆菌中表达,结果表明:蓝藻HoxEFUYH蛋白的异源表达提高了细菌的产氢能力,最大产氢速率和累积产氢量均比原菌有较大幅度提高,其中,表达F和U亚基的重组菌株E.aerogenes/HoxFU的产氢量最高,从未重组前的1.14 mol H_2/mol葡萄糖提高达到2.29 mol H_2/mol葡萄糖,最大产氢速率达到113.4 mL·L~(-1)·h~(-1),表达U、Y和H亚基的重组菌株E.aerogenes/HoxUYH的产氢量最少,从未重组前的1.14mol H_2/mol葡萄糖提高到1.82 mol H_2/mol葡萄糖,最大产氢速率为41.6mL·L~(-1)·h~(-1)。但是目前蓝藻氢酶重组后的作用机制还不清楚,有待于进一步的研究。


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