稻瘟病菌细胞自噬相关基因MgATG4表达模式与功能分析

【摘要】： 细胞自噬是真核生物中高度保守的过程,在此过程中,包括过剩或异常的细胞器在内的细胞物质被包裹进双层膜的自噬泡中并被运输到溶酶体或液泡中进行降解,从而使得生物大分子得以重新利用。细胞自噬在诸如对变化环境的适应、发育与分化过程中细胞形态的建成以及细胞寿命的决定等一系列生物事件中起着重要作用。细胞自噬相关基因最早在酵母中被鉴定,如今在所有的高等生物中已发现其同源基因。细胞自噬可由饥饿诱导产生并维持一个氨基酸库以便合成一些必需的蛋白质。 稻瘟病是一种由稻瘟病菌引起的毁灭性病害,给全世界的水稻生产带来巨大威胁。稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)具有典型的生活史和侵染循环,且被认为是丝状真菌分子生物学和病原菌与寄主互作研究的模式生物。稻瘟病菌能够形成专门的侵染结构—附着胞,其能够产生巨大的胞内膨压(约8.0Mpa),这个压力使稻瘟病菌穿透植物叶片表皮并侵染寄主。 本研究主要目的是阐明细胞自噬相关基因MgATG4的表达模式,细胞自噬与稻瘟病菌生长、发育和致病性之间的关系以及细胞自噬相关蛋白MgATG4与MgATG8之间的相互作用。获得的主要研究结果如下: 从稻瘟病菌成熟附着胞的差减文库中克隆到了细胞自噬相关基因MgATG4,该基因编码一个53.93kDa的半胱氨酸蛋白酶。将稻瘟病菌MgATG4基因,互补到酵母ATG4基因缺失突变体中,能够恢复酵母的细胞自噬过程;对MgATG4进行时间表达模式分析,发现该基因在孢子、附着胞及菌丝中均有表达;细胞定位分析发现MgATG4蛋白在细胞质中均匀表达。 通过构建MgATG4基因置换载体,得到MgATG4基因缺失突变体△mgatg4。△mgatg4突变体在CM培养基上的菌落形态发生变化,菌丝稀疏;产孢量显著下降,约为野生型Guy11的1/90;分生孢子的萌发及附着胞形成延迟;附着胞膨压显著下降,在完整的水稻或者大麦叶片上不能形成可见病斑,致病性丧失;在有磨损的大麦叶片上也未能产生病斑;突变子在OMA培养基上与2539菌株交配,能产生子囊壳,但延迟且量极少;基因MgATG4的缺失,使细胞自噬过程中断,液泡和细胞质中无自噬泡的积累。 从稻瘟病菌成熟附着胞的差减文库中克隆得到了另一个细胞自噬相关基因MgATG8,该基因编码一个14.4kDa的ATG8蛋白。对MgATG8进行时间表达模式分析,发现该基因在孢子、附着胞及菌丝中均有表达。通过双分子荧光互补技术检测MgATG4与MgATG8在稻瘟病菌细胞发育过程中的相互作用,分别构建BiFC载体ATG4-YFPN、ATG4△-YFPN和YFPC-ATG8共转化稻瘟病菌Guy11菌株并用潮霉素和草胺磷双抗筛选。转化子BY-7经共聚焦显微镜检测结果发现在孢子、营养菌丝、附着胞形成过程及穿透过程中均没有检测到YFP荧光信号,但在饥饿诱导4h后的菌丝中检测到了MgATG4与MgATG8的相互作用。 MgATG4蛋白序列中含有6个半胱氨酸残基。通过序列比对分析,发现MgATG4蛋白序列中的Cys206为保守半胱氨酸;分别构建MgATG4、MgATG8蛋白表达载体pPICZα-ATG4和pPICZα-ATG8,并采用定点突变技术将MgATG4第206位的半胱氨酸残基Cysteine突变为丝氨酸Serline。采用毕赤酵母表达系统表达野生型和突变体MgATG4-His融合蛋白以及MgATG8-His融合蛋白并纯化。体外蛋白酶切实验表明Cys206是MgATG4的活性位点。