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1,3-甘油二酯对2型糖尿病的影响及选择性水解甘油三酯sn-2位酯键酶基因的克隆与表达

徐同成  
【摘要】: 2型糖尿病(T2DM)是一种世界性的流行性疾病,其患病率日益升高,且日趋年轻化。研究表明,T2DM与膳食脂肪摄入之间存在相关性。1,3-甘油二脂(1,3-DAG)是天然油脂的微量组成成分,以1,3-DAG替换膳食中的甘油三酯(TAG),可以降低T2DM老鼠血清胰岛素和瘦素的浓度,改善T2DM人群的血脂代谢。但1,3-甘油二酯的摄入是否可以改善T2DM患者葡萄糖代谢相关指标,目前尚无大规模人体实验证实。天然油脂中1,3-DAG的含量极低,需通过对现有油脂资源进行改造而制备。目前在市场上销售的富含1,3-DAG的食用油是采用化学法制备而成,不易为消费者所接受,而利用脂肪酶制备1,3-DAG受到越来越多的关注。南极假丝酵母脂肪酶A(CAL-A)具有倾向性水解TAG sn-2位酯键的特性,可以利用其制备1,3-DAG。但该酶在原始菌株中产量极低。本学位论文拟调查1,3-DAG对T2DM的影响,并在外源蛋白表达系统中对编码CAL-A的基因进行表达,利用表达的重组脂肪酶水解TAG而制备1,3-DAG。 本学位论文主要内容分述如下: 采用双盲的、平行对照的膳食干预研究,评价1,3-DAG对T2DM的影响。共招募杭州地区127名40~65岁的T2DM受试者,随机分成两组,分别摄入等量DAG(1,3-DAG占64%)或TAG 120天。分别在第0、60和120天测定受试者生理参数并采集血液样品。采用商业化试剂盒对受试者的肝肾功能指标、血脂代谢指标、血糖浓度、血清胰岛素和瘦素浓度进行检测;采用气相色谱法检测受试者血清磷脂脂肪酸组成;胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)由以下公式进行计算:HOMA-IR=空腹胰岛素浓度×空腹血糖浓度/22.5。共有112名受试者完成本次实验,其中DAG组60人(36名女性,24名男性,平均年龄54.1±6.7岁),TAG组52人(29名女性,23名男性,平均年龄53.9±6.0岁)。结果发现,DAG组和TAG组受试者的体重均显著下降(p<0.05),但DAG组的下降幅度(1.2 kg)显著大于TAG组的幅度(0.5kg)(p<0.05)。DAG组受试者的腰围和臀围显著下降(p<0.05),TAG组的腰围和臀围未出现显著变化。DAG组受试者的血清葡萄糖浓度由第0天的7.4 mmol/L下降至第120天的7.06mmol/L,而TAG组则由第0天的7.81 mmol/L上升至第120天的7.88 mmol/L,均未达到显著水平。DAG组受试者的血清胰岛素和瘦素浓度均明显下降,但未达到显著水平,而TAG组胰岛素和瘦素浓度均显著升高(p<0.05)。DAG组受试者的胰岛素抵抗指数显著下降(p<0.05),而TAG组的胰岛素抵抗指数明显升高,但未达到显著水平。两组之间肝肾功能相关指标及血清磷脂必需脂肪酸组成无显著差异。 以南极假丝酵母基因组为模板,对编码CAL-A的基因序列进行扩增,然后与原核表达载体pET-28a连接构建成重组载体,并将其转化入大肠杆菌DH5α中。通过抗生素平板和PCR扩增,筛选和鉴定重组子,并对其进行诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,重组脂肪酶以包涵体的形式存在。采用尿素处理后,未恢复其活性。 将编码CAL-A的PCR扩增产物与酵母分泌型载体pPIC9K连接构建成重组载体,并将其电转化入毕赤酵母GS115中。通过最小葡萄糖培养基和最小甲醇培养基及PCR扩增,筛选和鉴定重组子。重组酵母经192 h培养后,发酵液上清酶活达到17.4 U/mL。SDS-PAGE显示,重组脂肪酶分子量约为50 kD。粗酶液经中空纤维素膜超滤浓缩和离子柱交换层析后,得到经SDS-PAGE分析表明为单一条带的重组脂肪酶。该酶最适反应温度为75℃;热稳定性高,在70℃及以下温度保持30 min后仍具90%以上的酶活性;最适反应pH值为7.0,在pH 6.0~8.0的范围内具有较好的稳定性;Co~(2+)和EDTA溶液对重组脂肪酶的活性具有促进作用,Hg~(2+)对脂肪酶活性具有抑制作用,Ca~(2+)、Zn~(2+)、Ag~+等离子对脂肪酶的活性无显著影响。 将三油酸甘油酯与水以3:1(w:w)的比例混合,并加入占三油酸甘油酯重量2%的重组脂肪酶,60℃200 rpm反应35 h后,反应体系中的1,3-DAG含量约为14%。采用短程蒸馏法除去反应体系中的水、甘油、自由脂肪酸和甘油单酯后,最终产物中1,3-DAG的含量可以达到43%。 本学位论文检验了1,3-DAG对T2DM的影响。与TAG相比,1,3-DAG的摄入可显著降低T2DM患者体重、体重指数、腰围、臀围、胰岛素抵抗、血清胰岛素和瘦素浓度等指标:1,3-DAG可提供与TAG相同的必需脂肪酸,且对患者肝肾功能无毒副作用。将CAL-A基因序列与酵母分泌型载体pPIC9K连接构建重组载体,并将其转化进入组氨酸缺陷型酵母GS115中,成功进行了表达。重组脂肪酶分子量约为50kD;粗酶液经纯化后,得到电泳纯的重组脂肪酶。该重组脂肪酶具有很好的热稳定性,且对金属离子的毒害作用具有一定的抵抗性。利用重组CAL-A倾向性水解TAGsn-2位酰基,成功制备了1,3-DAG,1,3-DAG的含量可达43%。


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