Y家族DNA聚合酶对化学致癌物MNNG应答的转录调控研究

【摘要】： 单功能烷化剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)是一种在实验室中普遍使用的模式化学诱变剂和致癌剂,用于研究环境中广泛存在的N-亚硝胺类化学物质的致突变致癌机制。MNNG能与DNA及蛋白质等生物大分子形成加合物,引起突变和其它损伤。本实验室长期致力于MNNG等环境化学污染物引起细胞损伤机制的研究,并对MNNG等诱发非定标性突变以及细胞遗传不稳定的机制提出了以下假设:致突变致癌物经由DNA损伤和非DNA损伤途径诱发一系列信号转导通路的激活,引起相关基因表达发生改变,包括DNA聚合酶表达谱改变,致使DNA复制保真度下降,最终可导致非定标性突变和细胞遗传不稳定的形成。为深入探讨MNNG引起DNA复制保真度下降的机制,我们对具有低复制保真度特点、参与跨DNA损伤合成的Y家族聚合酶Polη、Polι和Polκ的启动子及其对MNNG应答的转录调控机制进行了研究。 主要研究方法和结果: a.应用生物信息学软件结合进化足迹法对POLH、POLI和POLK启动子及其转录因子结合位点进行预测,并对它们共同的转录因子和可能的信号通路进行分析,推测E2F和STAT等相关信号通路可能在POLH、POLI和POLK的转录调控中起一定作用。 应用报告基因技术分析POLH、POLI和POLK启动子截短体的转录活性,对三个聚合酶的最小启动子区、转录激活区和抑制区进行了定位。 b.定量RT-PCR和/或免疫印迹试验检测发现10μM MNNG可以引起POLH、POLI和POLK转录上调。应用突变、报告基因和转录表达分析等技术发现:(1)过表达IRF1上调Polη表达;将POLH启动子区-898位或-590位IRF1结合位点突变后,过表达IRF1不能引起其转录上调,也抑制了MNNG引起的POLH启动子的活性增加,说明IRF1与-898位和-590位结合,参与调控MNNG诱导的POLH的转录上调。(2)MNNG引起POL1的转录激活,Sp1在MNNG诱导POLI的转录调控中起一定作用。(3)MNNG可能通过多个转录因子的协同作用调节POLK的表达,而起主要调控作用的转录因子有待于进一步研究。 c.为了研究调控基因表达的“转录因子组”,我们初步建立了DNA pulldown-质谱检测方法,为下一步研究基因的转录调控机制提供有力的工具。 主要结论:(1)首次系统研究了Y家族DNA聚合酶POLH和POLI启动子的活性,发现POLH和POLI启动子上的多个反应元件参与基因的转录调控,有的是正向调控,有的则是负向调控;(2)首次证明了IRF1和Sp1分别参与了MNNG诱导的POLH和POLI的转录激活调控;(3)初步建立的DNA pulldown-质谱检测方法可用于鉴定与基因启动子序列结合的多个转录因子。 本课题的研究有助于进一步阐明Y家族聚合酶在DNA损伤应答过程中的转录调控机制,为探索化学致突变致癌物的作用机制及干预的新途径提供了新的实验依据。