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针对Hh信号通路的人恶性胶质瘤靶向治疗的实验研究

马力  
【摘要】: [研究背景] 胶质瘤是颅内最常见恶性肿瘤,其中病理分级为WHOⅢ-Ⅳ级的恶性胶质瘤,病情进展迅速,复发快,预后差。目前手术结合放、化疗的综合治疗是经典的治疗方法,但对于恶性胶质瘤患者的总体预后改善有限,主要原因在于难以避免的肿瘤复发。恶性胶质瘤的化疗是重要的辅助治疗手段,然而由于传统化疗药物的非特异性、细胞毒性和肿瘤本身的耐药性使得该类药物的总体疗效欠佳。近年来发现许多肿瘤的发生发展与特定信号通路的异常激活密切相关,因此以细胞特定受体、关键基因和调控分子为靶点的辅助治疗具有良好的应用前景。 肿瘤干细胞假说认为在肿瘤细胞中仅有一小部分细胞具有自我更新、无限增殖、多向分化潜能的干细胞样特性,它们是肿瘤发生,转移和复发的根源。已经发现胶质瘤中也存在着这样一类以CD133阳性作为标记的脑肿瘤干细胞(BTSCs),并且证明其具有高度的耐药性、抗凋亡能力以及侵袭能力。这些肿瘤干细胞应该是今后恶性胶质瘤靶向治疗的主要研究方向。目前认为脑肿瘤干细胞可能起源于发生基因突变的正常神经干细胞,因而一些负责调控神经干细胞自我更新、分化、增殖的关键信号通路,如Hh、Wnt、Notch信号通路等,可能在脑肿瘤干细胞中起着重要的作用。其中Hh通路是目前肿瘤干细胞相关研究领域的热点之一。已有的研究表明:Hh通路既对内源性干细胞的增殖起调节作用,也可能对肿瘤干细胞起调节作用,其异常激活能导致多种肿瘤生成,如基底细胞癌、髓母细胞瘤、胶质瘤、胰腺癌等;目前体内外实验中对该通路的特异性阻断对这些肿瘤的治疗均取得了一定的效果,但其中的具体作用机制还没有完全阐明。因此对该信号通路的继续探索也成为了目前相关肿瘤基础研究领域的前沿。 目前针对Hh通路应用较多的一类阻滞剂为环杷明(cyclopamine),其能够结合Smo受体从而抑制Hh信号通路活性。已有的体内外实验表明cyclopamine对包括部分胶质瘤在内的多种Hh通路相关性肿瘤有效。然而cyclopamine类抑制剂只能对由Hh信号通路上游基因变化导致异常活化的肿瘤有作用-而对由Smo级联反应以下的参与Hh信号通路调控的分子变化,如sufu基因突变所导致的肿瘤没有治疗效果。因此,进一步寻找Hh通路下游阻滞剂,如Gli转录因子阻滞剂,对于Hh通路相关性胶质瘤的干预治疗具有重要意义。 [方法] 第一部分:通过rt-PCR和免疫荧光技术检测Hh通路的主要基因Gli1在不同的原代细胞及胶质母细胞瘤细胞系中的表达;分别利用real-time PCR. western blot验证GANT61对Hh通路异常激活的胶质瘤Gli1 mRNA和Ptch1蛋白的调控作用;利用MTS试验,验证GANT61对不同株胶质瘤细胞活性的影响,并根据此项试验结果得出的时间-剂量-活性相关曲线确定该药物的有效浓度;进而借助于PI染色法检测GANT61对细胞周期的影响,并以Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡 第二部分:利用免疫磁珠分选技术(MACS)在U87细胞系中分选得到CD133阳性的脑肿瘤干细胞,并通过单克隆形成试验、免疫荧光标记和裸鼠致瘤试验鉴定其干细胞样生物学特性;然后予以GANT61体外作用相应时间后再次检测脑肿瘤干细胞自我更新能力、干细胞特异性标记的维持以及裸鼠致瘤能力的变化。 第三部分:通过裸鼠皮下接种法构建胶质瘤的种植瘤模型,按疗程瘤周注射GANT61后定期测量肿瘤体积变化;收集处理组与对照组新鲜肿瘤组织以PCR和免疫组化技术分别检测Ptchl mRNA和蛋白水平的变化;以TUNEL法标记凋亡细胞,以BRDU染色法检测肿瘤细胞的增殖。另取GANT61干预后的肿瘤组织体外再培养并检测其自我更新能力和体内致瘤能力。 [结果] 1.在7例恶性胶质瘤样本中3例为WHOⅢ级,4例为WHOⅣ级。其中2/5原代肿瘤细胞和1/2肿瘤细胞系的Gli1高表达。但Gli1的表达情况与病理分级没有明确的相关性。 2.5μM浓度的GANT61能够在体外实验中时间依赖的阻断Gli1转录活性,3个样本作用48h后Gli1 mRNA均得到明显下调,作为Gli1下游靶基因之一的Ptch1的蛋白表达也较对照组下降,说明GANT61能通过抑制Gli1转录活性来阻断其下游的信号传导。 3.GANT61对于Gli1表达异常增高的恶性胶质瘤具有时间和剂量依赖的细胞活性抑制作用,作用48h可以达到最大抑制效果,其IC50为10μM。 4.10μM的GANT61作用48h可以明显增加G1亚峰和G0/G1期的细胞比例,这提示GANT61主要通过诱导G1/S期的周期阻滞和增加细胞死亡来减慢胶质瘤细胞增殖。 5.10μM的GANT61作用48h可以通过降低Gli1转录活性而增加早期凋亡细胞比例。 6.通过MACS技术从U87细胞系中分选出CD133阳性的细胞亚群。经验证分选所得的CD133阳性细胞具有自我更新、多向分化潜能和体内致瘤能力,具有脑肿瘤干细胞样细胞(BTSCs)的典型特征。 7.CD133阳性组胶质瘤细胞Gli1 mRNA水平较阴性组明显增高。10μMGANT61作用48h后能明显抑制BTSCs Gli1转录活性。 8.10μM GANT61共培养2天或20μM GANT61共培养7天都不能明显增加BTSCs早期凋亡,这提示在BTSCs中Hh通路可能并不是唯一调控其抗凋亡能力的信号通路。 9.CD133阳性细胞与10μM GANT61共培养7天后,其肿瘤球样克隆形成能力明显减弱,CD133阳性率明显下降,将其接种至裸鼠皮下后未能致瘤。这提示GANT61对BTSCs的体外作用能降低其自我更新能力。 10.用浓度5mg/ml、剂量20mg/kg的GANT61对皮下荷瘤裸鼠作隔天瘤周注射,2周后处理组种植瘤体积较对照组明显小 11.对照组瘤体中Ptch1呈高表达,而在治疗组经过2周GANT61局部皮下注射后瘤体的Ptch1在mRNA和蛋白水平均明显下降。 12.在体内环境下GANT61能提高肿瘤的TUNEL阳性率并降低BRDU标记的的阳性率,提示其能增加肿瘤细胞凋亡、抑制增殖。 13.处理组种植瘤消化后经体外培养发现仍能形成肿瘤球样克隆,并具有裸鼠致瘤能力。这提示在体内实验中单独使用GANT61不能完全消灭肿瘤干细胞。 [结论] 1.在恶性胶质瘤中存在Hh通路活性异常增高的亚型,以Gli1 mRNA的高表达为主要表现。但Gli1的表达情况与病理分级没有明确的相关性。 2.在体外实验中GANT61能通过抑制Gli1转录来降低胶质瘤细胞活性,这种作用主要通过G1/S周期阻滞和增加细胞凋亡来实现。 3.体外分选得到的CD133阳性的BTSCs呈Gli1高表达,其能被GANT61所抑制,同时该药物还能抑制BTSCs自我更新能力,但对其抗凋亡能力无明显影响。 4.体内实验中GANT61能通过抑制Gli1转录活性来抑制肿瘤细胞增殖、增加其凋亡,从而抑制肿瘤体积的增大。但该药物在体内未能完全根除BTSCs。


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