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非小细胞肺癌细胞中Nrf2信号通路抑制作用的研究

曲丽艳  
【摘要】: Nrf2-ARE信号通路在肿瘤化学预防和肿瘤耐药性两方面起着重要作用,Nrf2在细胞核中的累积可以导致肿瘤细胞获得耐药性,而且现已成为增敏肿瘤细胞的有效药靶。本研究主要分为3个部分。 第一部分:通过构建Keap1高表达的稳定细胞株,探讨Keap1对Nrf2信号通路的影响。我们将野生型mKeapl-pEGFP转染非小细胞肺癌细胞A549和H460,通过Western blot、免疫细胞化学、PCR筛选得到Keap1稳定表达的细胞株A549-mKeap1-pEGFP(H1)和H460-mKeap1-pEGFP(N5),同时转染pEGFP建立对照组细胞株。与对照组相比,Keap1高表达的细胞株中Nrf2与其调控蛋白质的表达均有降低。MTS法分析数据显示,与对照组细胞株相比,H1对抗癌药物奥沙利铂更敏感,在H460-N5细胞株中,抗癌药物奥沙利铂、阿霉素和依托泊苷的增敏作用明显增强。可见,Keap1过表达后,降低了Nrf2及其调控基因的表达,增敏非小细胞肺癌细胞对抗肿瘤药物的作用。 第二部分:利用细胞核亚细胞器结构的一些特异性蛋白质:Coilin、SMN、SC35、核孔复合体(nuclear pore complex, NPC)、RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)及Y12等标记亚细胞器,研究Nrf2小分子抑制剂贝沙罗汀(Bexarotene)对Nrf2转录活性影响的机制,同时对Nrf2在细胞中的定位进行了探讨。激光共聚焦显微镜显示,A549细胞中Nrf2与coilin、SMN之间存在共定位,Bexarotene作用6h后,Coilin的表达增加,且Nrf2与coilin的共定位增加,与转录抑制剂5-6-dichloro-l-B-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB)对细胞作用1h时的结果类似;SMN的表达也增加,且Nrf2与SMN的共定位增加,这一结果与鹅膏蕈碱(a-amanitin)对细胞作用1h时的结果相似,但是这一现象需要进一步验证。由此可见Bexarotene可能通过coilin和SMN等亚细胞器对Nrf2进行调控。 第三部分:为了进一步研究Nrf2和coilin、SMN之间的相互作用关系,将coilin转染A549细胞,发现其与Nrf2存在共定位现象;通过免疫共沉淀发现Nrf2与SMN存在相互作用。在其他一些细胞中都可以发现Nrf2与coilin、SMN的共定位。因此证明Nrf2与coilin、SMN之间存在共定位现象,并且具有普遍性。在结肠癌Caco2细胞中,可见共定位现象,Bexarotene作用后,共定位增加,但是本实验尚需进一步研究。


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