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PPAR-γ激动剂吡格列酮抑制血管紧张素Ⅱ诱导树突状细胞免疫激活致动脉粥样硬化斑块不稳定的研究

朱伟国  
【摘要】: 体外研究:PPAR-γ激动剂吡格列酮抑制外源性血管紧张素Ⅱ诱导树突状细胞功能活化及其信号转导机制 目的:肾素血管紧张素系统在树突状细胞(dendritic cell, DC)上表达并具有功能活性,提示血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)可能通过调节DC功能在免疫炎症反应过程中发挥重要的作用。本部分体外研究过氧化物酶体增生物激活受体-γ(peroxisome protiferator activated receptor-gamma, PPAR-γ)激动剂吡格列酮(pioglitazone, Pio)对外源性AngⅡI诱导DC功能活化的影响,并进一步探讨其内在的信号转导机制。 方法:体外分离培养人外周血单核细胞来源的DC,直接加入AngⅡ干预,或者经PPAR-γ激动剂Pio预处理后再加入AngⅡ干预。然后采用流式细胞学技术检测DC表达表型分子CD80、CD86、CD83和HLA-DR的功能,酶联免疫吸附试验检测DC分泌细胞因子IL-6、TNF-α和IL-12的功能,混合淋巴细胞反应检测DC刺激T淋巴细胞增殖的功能。进一步通过蛋白印迹试验检测DC内丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)的磷酸化,电泳迁移率转变试验检测DC内核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)的活性。 结果:外源性AngⅡ的刺激能上调人单核细胞来源DC表面的成熟标记分子CD83和共刺激分子CD86,但对共刺激分子CD80和MHC-II类分子HLA-DR的表达无显著影响;能促进DC分泌炎症因子IL-6和TNF-a,但对T淋巴细胞刺激因子IL-12分泌的促进作用不明显;能显著增强成熟DC刺激的T淋巴细胞增殖反应,但对未成熟DC刺激T淋巴细胞增值能力的增加不明显。经PPAR-γ激动剂Pio预处理能明显抑制AngⅡ诱导DC上调CD83分子表达,但对AngⅡ上调CD86分子表达无显著影响;能减少Ang II促进DC分泌IL-12和TNF-a,但对Ang II刺激IL-6分泌影响不大;Pio还能够阻断Ang II协同刺激DC激活T淋巴细胞增殖反应。进一步研究发现,外源性AngⅡ刺激人单核细胞来源DC能促进DC内细胞外信号调节激酶(extracellular signal-related kinase, ERK)和P38 MAPK的磷酸化,但对c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)磷酸化的作用不明显;还能增强DC内NF-κB/DNA结合活性。经PPAR-y激动剂Pio预处理能明显抑制AngⅡ促进DC内ERK和P38 MAPK的磷酸化,而且还能降低AngⅡ增强的DC内NF-κB/DNA结合活性。 总结:PPAR-γ激动剂Pio能抑制外源性AngⅡ诱导DC功能活化,其内在的分子机制至少部分是通过阻断MAPK和NF-κB信号转导通路实现的。这些研究的发现进一步证实了上述多种介质相互作用在调节DC介导的免疫炎症过程中具有十分重要的作用。 体内研究:PPAR-y激动剂吡格列酮抑制内源性血管紧张素Ⅱ致ApoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块不稳定及其免疫炎症机制 目的:动脉粥样硬化易损斑块破裂是引起急性心血管事件的主要原因,但是导致斑块失稳的具体机制至今仍未完全阐明。在前面的体外研究中我们已经发现PPAR-γ激动剂Pio能抑制外源性AngⅡ诱导DC功能活化,本部分实验通过建立内源性高AngⅡ动脉粥样硬化小鼠模型,研究在体情况下PPAR-γ激动剂Pio对内源性Ang II诱导ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块不稳定的影响,并进一步探讨DC介导的免疫炎症机制在动脉粥样硬化斑块易损中的作用。 方法:在Apo-/-小鼠的基础上进行两肾一夹(two kidney one clip,2K1C)手术,建立内源性高AngⅡ动脉粥样硬化小鼠模型,另行假手术作为对照。2K1C术后小鼠分成两组,其中一组予PPAR-y激动剂Pio 20 mg/kg/d灌胃,称为2K1C+Pio组,另一组予等量生理盐水灌胃,称为2K1C组;假手术小鼠也分成两组,其中一组予Pio 20 mg/kg/d灌胃,称为sham+Pio组,另一组予等量生理盐水灌胃,称为sham组。各组小鼠严格按照实验计划连续处理12周,然后经有创颈动脉测压法测定动脉血压,常规生化检测血脂、血糖水平,放射免疫法检测血浆肾素活性和Ang II浓度;主动脉弓大体照片和胸腹主动脉油红O染色观测主动脉斑块负荷,主动脉根部组织切片苏木精-伊红染色和平滑肌细胞肌动蛋白免疫组化染色评价斑块易损性,CD3免疫组化染色T淋巴细胞,S-100蛋白和C-C家族趋化因子受体-7(C-C chemokine receptor type 7, CCR7)免疫组化双染色DC检测斑块内免疫炎症细胞的浸润及功能状态。 结果:成功建立内源性高Ang II动脉粥样硬化小鼠模型,2K1C术后ApoE-/-小鼠动脉血压显著增高,血浆肾素活性明显增强,Ang II浓度显著增高;Pio药物干预以后ApoE-/-小鼠动脉血压无明显变化,虽然血浆肾素活性增强,但Ang II浓度未见明显差异;2K1C术后和Pio药物干预对ApoE-/-小鼠体重、心率,血脂、血糖水平均无明显影响。2K1C术后所致的内源性高Ang II能促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化发展:主动脉弓和胸腹主动脉的斑块负荷增加,斑块面积增大;还能促进斑块易损性:斑块脂质核心增大,纤维帽变薄甚至破坏,斑块内平滑肌细胞含量减少,T淋巴细胞浸润增加。Pio药物治疗能延缓内源性Ang II所致的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化进展:主动脉弓和胸腹主动脉的斑块负荷降低,斑块面积减少;还能抑制斑块的易损性:脂质核心减小,纤维帽增厚并且连续完整,斑块内平滑肌细胞含量增加,T淋巴细胞浸润减少。进一步研究发现,2K1C术后所致的内源性高Ang II能促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内DC浸润及功能活化:斑块内CCR7阳性DC含量增加,主要分布于斑块的肩部或斑块核心的边缘区域,并且与T淋巴细胞聚集在一起激活斑块内局部免疫炎症反应。Pio药物干预能抑制内源性AngⅡ所致的斑块内DC浸润,并降低斑块内CCR7阳性DC的含量。 总结:PPAR-γ激动剂Pio能抑制内源性Ang II所致ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化发展及斑块不稳定,其可能的机制之一与调节DC介导的免疫炎症反应相关。这些研究结果进一步证实了DC介导的免疫炎症机制在Ang II诱导动脉粥样硬化发展及斑块不稳定中的作用,同时也为临床选择使用PPAR-γ激动剂如噻唑烷二酮类药物以DC为靶点预防和治疗动脉粥样硬化提供科学的理论依据。


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