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肝病患者粪便上清代谢组学研究及肠道菌群对代谢的影响

黄海军  
【摘要】: 研究背景 我国肝脏疾病发病率高,影响面广,对人民健康和国家经济产生了严重危害。因此,针对肝脏疾病的早期诊断及发病机制的研究具有十分重要的意义。 肝脏是机体重要的代谢器官,在物质代谢过程中起了枢纽作用。当肝脏发生病理改变时,必然会导致与之相关的代谢网络发生相应的变化。代谢组学是从整体层面上检测疾病状态下代谢物的改变,因而代谢组学技术在肝脏疾病的早期诊断及发病机制等方面研究中起到了不可忽视的作用。粪便代谢物被认为肠道菌群和宿主共代谢的产物,它不仅可以反应肠道菌群的状态,而且在共栖菌与宿主之间起着桥梁作用。因此应用粪便上清代谢组学的方法来研究不同阶段的肝病,对于研究肝病的发展与肠道菌群之间的联系有着重要的指导意义。 肠道共生菌明显影响宿主的代谢表型,广泛参与了菌群与哺乳动物的共代谢。肝脏与肠道菌群由于肠-肝轴建立了密切的解剖及生理功能关系。以往的研究表明,肝病时存在着肠道菌群失衡,但在肝病时肠道菌群失衡如何影响机体代谢尚未见报道。 本研究首先建立基于超高效液相色谱-质谱(UPLC/MS)的粪便上清代谢组学方法,并应用该技术对急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌和健康人粪便上清的代谢物质进行代谢组学研究。进一步应用实时荧光定量PCR的方法来分析肝硬化患者肠道主要菌群的变化,并分析肠道菌群的改变对机体代谢的影响。 第一部分基于UPLC/MS的粪便上清代谢组学方法的建立及在不同肝病中的应用 方法:重点考察甲醇/粪便(v/g)的比例、过滤膜的大小、电喷雾离子化模式对提取粪便代谢物的影响;建立基于超高效液相色谱-质谱(UPLC/MS)的粪便上清代谢组学方法。应用该技术对急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌和健康人进行粪便上清代谢组学研究。结合多变量数据分析来研究不同阶段肝病代谢谱的变化规律,评估代谢谱对不同阶段肝病诊断的有效性。 结果:建立了基于UPLC/MS的粪便上清代谢组学方法。确定甲醇/粪便(v/g)的比例为:600ul/0.2g,过滤膜的大小为(0.22μm),正离子模式,经方法学验证表明该方法重复性好、灵敏度高、分辨率高,适用于粪便上清代谢物的快速、高通量检测。应用该技术对急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌和健康人进行粪便上清代谢组学分析,对正常组与不同肝病组代谢组学数据进行主成分分析(principal components analysis, PCA)分析,结果显示正常组与疾病组的代谢谱有显著差别,但疾病组之间未能完全分别聚类,进一步运用监督的正交偏最小方差判别分析(Orthogonal Partial least squares-Discriminant Analysis, OPLS-DA)多变量统计方法对5组样本重新建模,结果显示正常组与不同疾病组之间能很好地区分,不同肝病组之间也能基本分开,提示用此模型可以对不同肝病进行诊断。为了分析不同肝病患者粪便上清代谢物的变化趋势,对分组贡献(VIP值)较大的代谢物进行了提取并鉴定了三大类物质:在肝病患者粪便中,胆汁酸和胆素原显著减少,溶血磷脂酰胆碱显著增加,进一步发现胆汁酸降低的严重程度依肝癌、肝硬化、慢性肝炎、急性肝炎排列,以肝癌患者中含量最低,降低最明显,这表明粪便中胆汁酸的含量可能与疾病进展程度相关。 第二部分:肝硬化患者肠道菌群结构改变对代谢的影响 方法:应用实时荧光定量PCR的方法来比较肝硬化患者与正常人群肠道主要菌群(肠球菌属、肠杆菌属、双歧杆菌属、拟杆菌属、梭菌属和乳酸杆菌属)的变化;对肝硬化UPLC/MS数据进行非参数Mann-Whitney Test检验,结合多变量统计分析,筛选肝硬化患者粪便的生物标志物,并分析肠道菌群改变对生物标志物的影响。 结果:实时荧光定量PCR检测肠道主要菌群结果显示:与正常人体比较,肝硬化患者肠杆菌科细菌显著增加(P0.01),拟杆菌、双歧杆菌和梭菌显著减少(P0.05),肠球菌和乳酸杆菌无显著性差异(P0.05)。应用PCA及最小二乘法判别分析(Partial least squares-Discriminant Analysis, PLS-DA)对正常人群与肝硬化患者UPLC/MS数据分析显示,肝硬化患者和正常人群代谢谱有显著不同。应用非参数Mann-Whitney Test检验,结果显示在9215个峰中,发现25.8%的峰即2393个峰有统计学意义,其中这些差异峰中有74.0%的代谢峰在肝硬化患者中下降,表明肝硬化患者大部分代谢产物都是下调的。根据VIP和非参数T-Test结果,我们鉴定了六大类物质:胆汁酸、胆素原、溶血磷脂酰胆碱、芳香族氨基酸、长链脂肪酸和长链酰基肉毒碱。与正常人群比较,肝硬化患者胆汁酸及胆素原显著减少,溶血磷脂酰胆碱、芳香族氨基酸、长链脂肪酸和长链酰基肉毒碱显著增加。 结论 本课题在建立基于UPLC/MS粪便上清代谢组学方法的基础上,通过对急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌和健康人群的代谢组学研究,并结合多变量统计分析发现代谢组学技术对不同肝病的诊断具有一定作用,可以为临床诊断提供实验室依据,同时发现粪便上清物中胆汁酸的含量可能提示疾病进展。实时荧光定量PCR检测肠道主要菌群结果显示肝硬化时存在肠道菌群失衡,并发现肠道菌群失衡对机体代谢产物产生一定程度的影响,特别是胆汁酸和胆素原。


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