碱基切除修复抑制剂甲氧胺联合β-榄香烯治疗恶性脑胶质瘤的实验研究

【摘要】： 胶质瘤是成人神经系统最常见的原发性肿瘤,手术全切除率很低,复发率高,当前多种治疗效果仍不理想。榄香烯属国家二类非细胞毒性抗肿瘤新药,临床研究发现其对多种肿瘤疗效确切,而且还具有提高和改善机体免疫功能,与放化疗协同作用等独特效果。但是肿瘤细胞具有强大的DNA损伤修复机制,会对化疗药物产生抗性。因此抑制这种内在的DNA修复过程,如碱基切除修复抑制剂甲氧胺的联合应用有利于提高化疗药物的抗瘤效果。此外,纳米脂质体能有选择性地增加药物在预期作用部位的浓度而提高治疗指数,并提供持续性的药物释放。纳米脂质体承载榄香烯的应用将有望成为一种新型的靶向性治疗胶质瘤的有效途径。本课题研究内容分两部分。 第一部分甲氧胺联合β-榄香烯抑制胶质瘤细胞增殖的实验研究 目的观察β-榄香烯单独及与甲氧胺联合用药在抑制胶质瘤细胞增殖过程中是否具有协同作用,以期减少β-榄香烯用量,降低毒副反应,为β-榄香烯在抗胶质瘤治疗方面的应用提供理论支持。方法 (1)体外实验：联合运用β-榄香烯与碱基切除修复抑制剂甲氧胺,分别以MTT、Western-blot、彗星试验、γ-H2AX焦点定量分析等方法检测联合用药的体外抑瘤效果； (2)体内实验：建立裸鼠C6胶质瘤细胞移植动物模型,分5组给药,空白对照组,β-榄香烯(ELE)组,甲氧胺(MX)组,ELE+MX联合用药组,阳性对照顺铂(DDP)组。定期观察肿瘤生长情况,测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率。 结果 (1)体外实验表明,甲氧胺联合β-榄香烯能显著抑制C6.SHG44胶质瘤细胞增殖,随着浓度的增加和作用时间的延长,其增殖抑制效应也随之增强；Westemblot检测结果表明,ELE+MX组γ-H2AX蛋白表达明显增多,但与单独ELE用药组比较未见明显差异；彗星实验结果显示,甲氧胺联合β-榄香烯处理胶质瘤C6细胞后,DNAH %、DNAT%、TL、TM和OTM分别为58.26±3.46%、41.74±3.46%、32.77±9.12、13.87±4.77和14.07±3.84(与对照组比,P0.05；P0.01)；γ-H2AX焦点形成结果显示,甲氧胺联合β-榄香烯处理的细胞中有近14%其细胞核内γ-H2AX焦点的数量为大于20个,8 h后,有约29%的细胞核内γ-H2AX焦点的数量大于20个(与对照组比,P0.05；P0.01)。 (2)体内实验表明,给药前,各治疗组肿瘤平均体积与对照组差异无统计学意义(均P0.05)。至第16天,各治疗组的肿瘤平均体积显著小于对照组(P0.05,或P0.01)。协同给药组RTV亦显著小于对照组(P0.05,或P0.01),且协同给药组的T／C为51.6%,小于榄香烯、甲氧胺的单独用药组。 第二部分纳米脂质体承载榄香烯诱导C6胶质瘤细胞凋亡的实验研究 目的探讨纳米脂质体承载榄香烯诱导C6胶质瘤细胞凋亡的作用及对相关基因caspase-3表达的影响。 方法榄香烯纳米脂质体的制备；以同等剂量的榄香烯-纳米脂质体、普通榄香烯和空白培养液作用于C6胶质瘤细胞,分别以MTT、流式细胞术检测联合用药对C6胶质瘤细胞的凋亡情况,以免疫组织化学法检测caspase-3蛋白的表达。结果 (1)MTT结果显示,榄香烯-纳米脂质体能显著抑制C6胶质瘤细胞增殖,随着浓度的增加和作用时间的延长,其增殖抑制效应也随之增强； (2)榄香烯-纳米脂质体和普通榄香烯组细胞于48 h和72 h时出现了明显的凋亡,而且其凋亡率明显高于空白对照组。 (3)榄香烯-纳米脂质体和普通榄香烯组细胞48 h和72 h时出现了明显的Caspase-3蛋白表达,而且其蛋白表达率明显高于空白对照组。 结论 (1)甲氧胺联合β-榄香烯对C6、SHG44胶质瘤细胞具有显著的增殖抑制作用,其增殖抑制作用具有明显的剂量-时间依赖性。 (2)甲氧胺能增强β-榄香烯对C6胶质瘤细胞造成的DNA损伤,可能是其能增强榄香烯抗肿瘤活性的机制之一。 (3)甲氧胺联合β-榄香烯对C6胶质瘤细胞作用后,可检测到γ-H2AX焦点的形成,表明甲氧胺联合β-榄香烯作用后导致了胶质瘤细胞修复能力的下降。 (4)β-榄香烯具有促进C6胶质瘤细胞凋亡和Caspase-3蛋白表达的作用,经纳米脂质体承载后榄香烯的这种作用有增强的趋势。