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全脑缺血再灌注后大鼠海马microRNA的变化及Let-7e调控Caspase-3表达和机制研究

袁圆  
【摘要】: 第一部分全脑缺血再灌注后大鼠海马microRNA的变化 全脑缺血再灌注过程中许多基因的表达发生变化,多种内源性损伤因子形成,启动一系列病理生理过程,导致神经元损伤进一步加重,即存在“缺血再灌注损伤”的机制。海马对缺血再灌注损伤最敏感,但其中的原因和作用机制并不明确。 MicroRNA(miR)参与许多生物学过程,大约调控动物1/3或以上的基因表达。关于microRNA参与脑血管病调控的研究刚刚起步,许多microRNA在脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制尚不明确。至今还没有关于全脑缺血后海马区microRNA表达谱及其变化的研究报道。 研究目的 研究大鼠海马]microRNA表达谱的特征及全脑缺血再灌注后的变化特点。 研究方法 1.采用四血管法建立大鼠全脑缺血再灌注模型。成年SD大鼠被分为4组:假手术组(S)组、20min全脑缺血再灌注30min(R30min)组、20min全脑缺血再灌注24h组(R24h)组、20min全脑缺血再灌注7d组(R7d)。 2.对S组、R30min组、R24h组、R7d组大鼠的脑组织作病理学检查,常规HE染色,观察海马CA1区神经元存活情况。 3.抽提S组、R30min组、R24h组大鼠海马总RNA,应用微离心过滤柱过滤得到小RNA,经过加poly(A)尾巴、荧光标记、杂交反应、采集杂交图象、数据处理等步骤完成包括Sanger miRBase Release 11.0版数据库中的350个大鼠microRNA在内的μParafloTM microRNA微阵列实验。 4.选择miR-9、let-7e、miR-29c 3个nicroRNA,采用实时荧光定量PCR对芯片结果作进一步验证。 5.应用靶基因预测软件,对实验结果中的部分microRNA的靶基因作预测。 研究结果 1.病理学检查显示全脑缺血再灌注后大鼠海马区的神经元呈迟发性死亡。 2.在大鼠海马区发现了286个nicroRNA,其中let-7家族表达量最高,占总microRNA的32%,miR-9和miR-125等也显示了较高的表达水平。 3.R30min组的海马区有266个microRNA表达,55个较S组有显著统计学差异,其中23个上调,32个下调。R24h组的海马区有278个microRNA表达,71个较对照组有显著统计学差异,其中40个上调,31个下调。不同的microRNA的表达水平在两个再灌注时间点的变化规律不同。 4.实时荧光定量PCR的结果与芯片结果基本吻合。 5.靶基因预测软件提示:Caspase-3是let-7a、let-7b、let-7c、let-7e、let-7i、let-7g的可能靶基因;EIF4E3、EIF4A1是miR-338的可能靶基因;Fos是miR-7a和miR-7b的可能靶基因;EIF4E、EIF5、ATF-1、CREB5和CREB2F是miR-9的可能靶基因。 结论 大鼠海马区显示了特殊的microRNA表达谱,提示microRNA参与了对海马正常生理功能的调控。全脑缺血再灌注后大鼠海马区的microRNA出现快速广泛的变化,提示microRNA是被积极调控的,并在转录后水平调控多种基因的表达。 第二部分Let-7e调控Caspase-3表达和机制研究 许多证据表明,凋亡与脑缺血缺氧导致的神经细胞损伤密切相关。Caspase家族蛋白是细胞凋亡过程中起关键作用的一类蛋白水解酶,其中Caspase-3 (Casp3)作为Caspase家族的重要成员,在启动和执行细胞凋亡,导致细胞死亡方面发挥了重要作用。 第一部分的实验发现:let-7e在再灌注30min、24h表达显著下调,靶基因预测软件提示Casp3是let-7e的可能靶基因。第二部分的实验我们旨在初步阐明let-7e是否通过负性调控凋亡关键蛋白Casp3的表达而实现对缺血再灌注后神经元凋亡的调控。 研究目的 初步阐明PC12细胞缺氧/复氧损伤(A/R)时,let-7e具有负性调控Casp3的表达,拮抗细胞凋亡的作用。 研究方法 1.培养鼠神经生长因子(NGF)诱导的PC12细胞。化学合成let-7e miR前体(pre-let-7e miR、pre-miR)、let-7e miR (let-7e)、前体miR对照(miR-NT)、let-7反义寡核苷酸链(anti-let-7e miR、anti-miR)、miR-NT反义寡核苷酸链(anti-miR-NT),转染PC12细胞,给予2小时缺氧缺糖续4小时复氧复糖培养。实验组分对照组(C)、缺氧复氧组(A/R)、转染NT的缺氧复氧组(A/R+NT)、转染let-7e的缺氧复氧组(A/R+let-7e miR)、转染pre-let-7e miR的缺氧复氧组(A/R+pre-miR)、转染let-7e及anti-miR的缺氧复氧组(A/R+miR+anti-miR)。 2.应用实时荧光定量PCR检测各实验组的let-7e和Casp3、Casp8、Casp9mRNA水平;用Western blotting检测各实验组的Casp3、Casp8、Casp9蛋白表达水平。 3.用MTT法检测各实验组的细胞存活情况。 4.用流式细胞仪检测各实验组的细胞凋亡情况。 研究结果 1.正常培养的NGF诱导的PC12细胞中let-7e有较高水平的表达,A/R损伤后let-7e表达水平下降。 2.A/R损伤后,Casp3、8、9的mRNA和蛋白表达水平增加伴细胞凋亡百分率增加、细胞活力下降。 3.与A/R组相比,转染了pre-miR或let-7e miR的PC12细胞在A/R损伤后,Caspase8、9的mRNA和蛋白水平无明显变化,而Casp3的mRNA和蛋白水平明显下降,同时伴细胞凋亡百分率减少、细胞活力增加。同时转染anti-let-7e miR则消除了这些保护作用。 结论 在NGF诱导的PC12细胞A/R损伤模型中,let-7e可负相调控Caspase3的mRNA和蛋白表达水平,发挥拮抗凋亡、保护细胞的作用。


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