收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

微囊化卵巢颗粒细胞长期体外培养及同种异体体内移植的研究

程静  
【摘要】: 绝经及绝经后期是妇女卵巢功能消失及其后的一段很长的时期。绝经所带来的一系列症状严重影响了妇女的自信心和生活质量,尤其是对那些POF和卵巢切除手术的年轻妇女。 对绝经期的更年期综合征,临床上通常采用的是激素替代治疗(HRT)或雌激素替代治疗(ERT),来弥补雌激素缺乏所带来的一系列症状。但HERS和WHI的两份报告对HRT的受益/风险比的重新进行界定使全球范围内的HRT在过去的几年的应用产生了停滞甚至是倒退。因此,探讨可行的内源性激素替代治疗方法对解决无生育要求的绝经妇女,特别是对POF的妇女意义重大。 细胞移植技术可以用于治疗人类某种蛋白或激素缺乏的疾病。细胞微囊化技术可以克服细胞移植治疗中的免疫排斥反应。以往对细胞微囊化移植的研究主要集中于胰岛、嗜铬细胞、肝细胞、甲状旁腺细胞、甲状腺细胞等治疗内分泌/代谢疾病和神经系统疾病,而对同样具有内分泌功能的卵巢颗粒细胞微囊化治疗绝经后的雌激素缺乏相关症状的研究目前国内外尚无报道。 为探讨微囊化卵巢颗粒细胞移植治疗绝经综合征的可行性,本研究主要从以下几个方面进行了研究:1.卵巢颗粒细胞的获取及体外活性和功能的研究;2.微囊化卵巢颗粒细胞的制备及体外活性和功能的研究;3.微囊化卵巢颗粒细胞异体移植对同种异体去势大鼠内分泌功能和生殖系统的影响;为临床上POF及绝经妇女微囊化卵巢颗粒细胞的同种异体移植提供理论基础。 第一部分卵巢颗粒细胞的获取及体外活性和功能的研究 目的:观察卵巢颗粒细胞长期在体外无血清培养体系中形态和内分泌功能的改变,探讨卵巢颗粒细胞在无血清体系中最长生存时间和生物学活性。 方法:1从26日龄未成年雌性SD大鼠获取原代卵巢颗粒细胞,采用FSHR对颗粒细胞进行免疫组化鉴定; 2 WST方法测定颗粒细胞在不同浓度FSH(0,2.5,25, 100ng/ml)刺激48小时后的OD值,判断颗粒细胞对FSH刺激的增殖反应; 3卵巢颗粒细胞长期体外培养45天,培养液中加添不同浓度的FSH(0,2.5,25ng/ml),显微镜下观察颗粒细胞的形态和数量的变化,ELISA法检测颗粒细胞培养液上清中E2和P的分泌。 结果:1免疫组化的结果提示卵巢颗粒细胞的FSHR位于细胞浆,获得的颗粒细胞的FSHR的阳性率90%; 2 WST方法检测到,体外培养的卵巢颗粒细胞的增殖对不同浓度的FSH(0,2.5,25,50,100ng/ml)呈剂量依赖性;WST作用后颗粒细胞的OD值随FSH浓度的增大而增大,FSH 100ng/ml组OD值最高,与其他组相比差异有显著性(P0.05); 3原代卵巢颗粒细胞24-48小时贴壁,贴壁后的成短梭形或多角形。第7-9天,细胞伸展成长梭形并完全融合;培养的第9天到第20天左右,细胞连接成片状,状态良好。从体外培养的第21天开始,细胞开始萎缩,凋亡,逐渐变得如干枯状,数量减少;至培养的第30天,细胞数量减少明显,剩余的细胞簇所占面积大约占六孔板每个孔面积的1/6至1/8左右。培养的第31天至45天,细胞凋亡的进程加快,到培养的第45天时,颗粒细胞大部分已解体,细胞结构消失。FSH2.5ng/ml和25ng/ml组未见明显加快颗粒细胞贴壁和融合,减慢颗粒细胞凋亡的作用。 4颗粒细胞在体外培养的第3,9,15,21,27,33,39和45天E2的分泌水平不同,差异有显著性(P<0.001),而不同浓度的FSH对颗粒细胞分泌E2的影响差异也有显著性(P=0.01)。FSHOng/ml组和FSH2.5ng/ml组培养的卵巢颗粒细胞在培养的第9天,E2的分泌达到最高峰(2244.6~2369.9) pg/ml,与培养的第3天相比差异有显著性(P0.05);培养的第15天到第39天内,E2水平保持较高水平,变化不大;到第45天时,颗粒细胞E2的分泌水平降至第3天水平(P0.05)。FSH25ng/ml组,在体外培养的第3天E2水平即达到最高峰2244.6pg/ml,第9天到第39天E2的分泌维持高水平,与第3天比差异无显著性(P0.05)。第45天E2水平降低至1869 pg/ml,显著低于第3天(P<0.05)。颗粒细胞体外培养第3天时E2的分泌水平对FSH浓度成剂量依赖性的增加,在FSH25ng/ml组分泌水平最高达2244.6pg/ml,差异有显著性(P=0.016)。 5颗粒细胞在体外培养的第3,9,15,21,27,33,39和45天P的分泌水平不同,差异有显著性(P=0.039);FSH浓度对颗粒细胞分泌P的影响差异也有显著性(P=0.035)。在FSHOng/ml组中,颗粒细胞在培养的第9天达到最高峰1.07ng/ml(P=0.006),第15天开始下降,一直维持在(7.6~8.1)ng/ml左右直到体外培养的第45天;而在FSH2.5ng/ml和FSH25ng/ml组在各时间点颗粒细胞分泌的P水平差异无显著性(P0.05)。在体外培养的第9天,FSH2.5ng/ml和FSH25ng/ml组P的产生量显著低于FSHOng/ml组,差异有显著性(P=0.021),其余各时间点不同浓度FSH对颗粒细胞产生P无显著影响(P0.05) 第二部分微囊化卵巢颗粒细胞的制备及体外活性和功能的研究 目的:制备微囊化的卵巢颗粒细胞,探讨微囊化卵巢颗粒细体外培养的生物学特性。 方法:1应用海藻酸钠和氯化钡采用“一步成囊法”制备微囊化卵巢颗粒细胞。 2 WST方法测定微囊化颗粒细胞在不同浓度FSH(0,2.5,25,50, 100ng/ml)刺激48小时的OD值,判断颗粒细胞微囊化后对FSH刺激后的增殖反应。 3对微囊化卵巢颗粒细胞进行长期体外培养60天,培养液中添加不同浓度的FSH(0,2.5,25ng/ml),显微镜下观察微囊及微囊内细胞的形态和数量的变化,ELISA方法检测微囊化细胞培养液上清中中E:和P的分泌情况。 结果:1.结果显示所制备的微囊直径750-800μm,呈规则球形或椭球形,颗粒细胞在微囊内分布均匀。体外培养60天,微囊形态保持良好,微囊内颗粒细胞无明显增多,FSH添加对微囊内颗粒细胞数量无显著影响。 2.通过WST方法检测到,微囊化卵巢颗粒细胞在体外培养48小时FSH各组间的OD值无显著性差异(P=0.876)。 3.微囊化的卵巢颗粒细胞在体外培养的第3,9,15,21,27,33,39,45,51,57和60天E2的分泌水平相似,在各时间点的E2水平差异无显著性(P=0.184)。不同浓度的FSH对微囊内颗粒细胞分泌E2的影响差异也无显著性(P=0.481)。但在体外培养的第3天,FSH2.5ng/ml组微囊内颗粒细胞分泌E2水平显著高于FSH0ng/ml和FSH25ng/ml组,差异有显著性(P=0.005) 4.微囊化的卵巢颗粒细胞在体外培养的第3,9,15,21,27,33,39,45,51,57和60天P的分泌水平不同,差异有显著性(P=0.002),而不同浓度的FSH对颗粒细胞分泌P的影响差异无显著性(P=0.069)。三组微囊化的卵巢颗粒细胞在培养的第15天时P的分泌增加显著(P=0.001),在体外培养的第21天达到分泌的高峰(P0.001),培养的第45天时,P的分泌开始下降,但仍保持稳定到培养的第60天。 第三部分微囊化卵巢颗粒细胞同种异体腹腔内移植对去势大鼠生殖系统和内分泌功能的影响 目的:观察微囊化卵巢颗粒细胞异体移植对去势大鼠血清中E2和P的分泌及子宫内膜、阴道脱落细胞的影响,探讨微囊化卵巢颗粒细胞异体移植作为激素替代治疗的可行性。 方法:12周龄成年SD大鼠分为4组,正常大鼠组,单纯去势组,微囊化卵巢颗粒细胞移植组、空微囊移植组。SD大鼠去势4周后腹腔内移入微囊化颗粒细胞和空微囊。移植后对各研究组的大鼠每10天尾静脉采血一次,分离大鼠血清,ELISA法统一测定血清中E2和P的水平;每天取阴道脱落细胞,在光镜下观察雌激素的影响;移植后60天,大鼠处死,采用HE染色方法对移植后大鼠的子宫进行染色,观察子宫内膜的变化。 结果:1移植后60天,大鼠处死后发现所移植微囊大部分粘附、包裹在腹腔脏器表面;回收的微囊形态完整,无破裂,表面被成纤维细胞、巨噬细胞等包裹。 2移植后大鼠体内随移植时间变化,E2分泌水平有显著性差异(P0.001),各分组间E2分泌水平也有显著性差异(P=0.001)。微囊化卵巢颗粒细胞移植组大鼠在移植后的第30天,E2的水平达最高峰,接近正常组大鼠的E2的水平(P0.05)。微囊化卵巢颗粒细胞移植组大鼠移植后第30天和第40天的E2的水平显著高于移植前水平(P=0.001,P=0.021),而其他时间E2的水平与移植前无显著差异(P0.05)。微囊化卵巢颗粒细胞移植对去势大鼠的P分泌无影响。 3去势大鼠子宫内膜变薄、腺体萎缩,微囊化卵巢颗粒细胞移植后子宫内膜增厚不明显,但内膜内出现腺体,腺腔较小 4微囊化卵巢颗粒细胞移植组的阴道脱落细胞与正常大鼠的发情前期或发情后期的表现相似,但无周期性变化。 结论 1.卵巢颗粒细胞微囊化前后均可在体外无血清培养体系中长期存活,并保持内分泌功能,可以作为产生内源性雌激素来源的细胞用于细胞移植。 2.颗粒细胞微囊化前后,E2分泌量差异显著,可能与微囊化过程和微囊材料的生物相容性有关。 3.FSH对颗粒细胞促进E2分泌作用显著,但对微囊化后的颗粒细胞促进E2分泌作用有限,可能与微囊限制了颗粒细胞的增殖有关。 4.微囊化卵巢颗粒细胞异体移植后可以使去势大鼠血清中E2阶段性升高,对去势大鼠的生殖系统有雌激素样作用,改善去势大鼠的“低雌状态”,有可能成为绝经后激素替代治疗一种新的治疗手段。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 赵莹;刘庆山;徐斯凡;;中药血清药理学方法在生殖系统研究中的运用[J];时珍国医国药;2011年04期
2 王静;刘英华;王晓军;;铅对大鼠原代卵巢颗粒细胞分泌雌激素能力的影响[J];中国职业医学;2007年04期
3 伊诺,孔涛,姜恩魁,薛晓鸥,王玲,刘敏,张丽菊;IGF-I对子宫切除所致大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用[J];锦州医学院学报;2005年01期
4 王雪梅;徐克惠;乔林;周瑞年;;米非司酮对体外大鼠卵巢颗粒细胞Fas表达影响的研究[J];生殖与避孕;2011年04期
5 邬静;袁慧;彭双清;;氯丙嗪对大鼠卵巢颗粒细胞损伤及其作用机制[J];毒理学杂志;2011年02期
6 袁其晓;;LHRH及其高活性类似物能刺激大鼠颗粒细胞中孕酮和前列腺素E的积累[J];国外医学.妇产科学分册;1983年02期
7 曹礼庭,谌伦华;超声诊断卵巢颗粒细胞-卵泡膜细胞瘤1例[J];川北医学院学报;2001年01期
8 吴荣芹;刘玉来;胡月枝;李庆昌;崔天成;郝彦格;;女性卵巢颗粒细胞移植抗早衰可行性研究[J];中国医药导报;2006年33期
9 张玉敏;马明月;段志文;裴秀丛;苏芯;;卵巢颗粒细胞体外培养体系的建立及DEHP、MEHP对其增殖功能的影响[J];沈阳医学院学报;2008年04期
10 彭国庆;田焱;金鸥;;甲醛对雌性大鼠卵巢颗粒细胞的影响[J];中国现代医学杂志;2010年17期
11 李沛霖;韩冰;杜永红;侯莉莉;;补肾调冲含药血清对离体卵巢颗粒细胞Bcl-2、P53蛋白表达的影响[J];天津中医药大学学报;2007年01期
12 崔姣;许惠琴;李莉;陈霞;;功血颗粒对卵巢颗粒细胞增殖和分泌作用的影响[J];吉林中医药;2011年03期
13 王春梅!哈尔滨150080,张辉!哈尔滨150080,倪江!哈尔滨150080,张玮!哈尔滨150080,张力;中药提取液对离体大鼠卵巢颗粒细胞雌二醇(E_2)分泌的影响[J];中医药信息;2000年02期
14 贾海梅;张文昌;陈昱;汪家梨;;镉对大鼠卵巢颗粒细胞孕激素合成的影响研究[J];中国预防医学杂志;2007年04期
15 吴媛霞;田秀珠;;体外受精-胚胎移植67例不孕症患者卵巢颗粒细胞凋亡率与妊娠结局的关系[J];山西职工医学院学报;2008年02期
16 祁冰;侯丽辉;吴效科;杨琳;宋家欣;;基因芯片研究小檗碱对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响[J];科技导报;2008年23期
17 祁冰;宋家欣;杨琳;吴效科;侯丽辉;;基因芯片研究隐丹参酮对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响[J];科技导报;2009年15期
18 禹良艳;华永庆;朱敏;王欢;唐于平;段金廒;;四物汤及其组成药对对大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响[J];中国实验方剂学杂志;2011年06期
19 禹良艳;华永庆;刘培;宿树兰;段金廒;;香附四物汤对大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响及活性部位成分分析[J];南京中医药大学学报;2011年03期
20 朱丽;郭成志;邓思君;鲁银;魏强;袁慧;;猪卵巢颗粒细胞分离培养及鉴定[J];中国兽医杂志;2011年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 丁婷;罗爱月;杨书红;赖志文;卢运萍;马丁;王世宣;;小鼠卵巢颗粒细胞不同分离方法的比较[A];中华医学会第三次全国绝经学术会议暨绝经相关问题学习班论文汇编[C];2011年
2 李荣芳;邬静;袁莉芸;文利新;袁慧;;氯丙嗪对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(下册)[C];2011年
3 邬静;彭双清;;氯丙嗪对大鼠卵巢颗粒细胞损伤及其作用机制[A];2010年全国药物毒理学学术会议论文集[C];2010年
4 庄新杰;黄怡;秦祖兴;吕敏;陆阳清;张明;卢克焕;;FSH和Insulin对水牛卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(下册)[C];2010年
5 郝红娟;王惠兰;张琰;张艳彬;;顺铂、VP-16、长春新碱、博来霉素对人卵巢颗粒细胞影响的比较[A];中华医学会第三次全国绝经学术会议暨绝经相关问题学习班论文汇编[C];2011年
6 肖蕴祺;倪迎冬;;Kisspeptin-10对鸡卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响及机制研究[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
7 赵海波;罗丽兰;;IGF-Ⅰ对人类卵巢颗粒细胞E_2和P产生量的影响及其与Ca~(2+)关系的研究[A];’96全国优生科学大会大会学术讲演与大会论文摘要汇编[C];1996年
8 朱丽;袁莉芸;邬静;李荣芳;文利新;袁慧;;ZEA诱导猪卵巢颗粒细胞凋亡机理的研究[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(上册)[C];2011年
9 张琰;王惠兰;郝红娟;张艳彬;;银杏黄酮对人卵巢恶性畸胎瘤细胞株PA-1及人卵巢颗粒细胞的影响[A];中华医学会第三次全国绝经学术会议暨绝经相关问题学习班论文汇编[C];2011年
10 江中良;胡建宏;史怀平;王立强;李青旺;;FGF1激活RTK/ERK通道诱导牛卵巢颗粒细胞Sprouty基因表达[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 程静;微囊化卵巢颗粒细胞长期体外培养及同种异体体内移植的研究[D];浙江大学;2010年
2 邬静;大鼠卵巢颗粒细胞体外生殖毒性评价替代模型的建立与应用[D];湖南农业大学;2011年
3 袁晓华;砷对卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响及分子机制研究[D];北京协和医学院;2011年
4 姚晶萍;痰湿型闭经的治疗及卵巢胰岛素抵抗的实验研究[D];黑龙江中医药大学;2006年
5 孙丽萍;顺铂对小鼠卵巢颗粒细胞芳香化酶活性和表达的影响及四物合剂的干预研究[D];北京中医药大学;2010年
6 白玉华;雷公藤多苷致雌性幼鼠生殖损伤及菟丝子黄酮干预其损伤的实验研究[D];北京中医药大学;2009年
7 陈璐;脑源性神经营养因子及神经营养因子4对大鼠促性腺激素分泌及其受体表达的影响[D];吉林大学;2012年
8 周芳;补肾活血法及其组方对PCO大鼠卵巢局部相关基因表达影响的研究[D];湖南中医药大学;2011年
9 魏兆莲;二甲双胍对PCOS患者卵巢颗粒细胞胰岛素受体底物-1及P450芳香化酶的作用[D];安徽医科大学;2011年
10 王晶;转化生长因子-β2对体外培养的人角膜内皮细胞增殖活性和形态的影响及其分子机理[D];中国海洋大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 朱丽;玉米赤霉烯酮对体外培养猪卵巢颗粒细胞的毒性作用及凋亡机理研究[D];湖南农业大学;2011年
2 凌志杰;骨髓间充质干细胞对卵巢颗粒细胞凋亡的作用研究[D];福建医科大学;2011年
3 肖蕴祺;Kisspeptin-10对鸡卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响及机制研究[D];南京农业大学;2011年
4 陈侠;组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A对猪卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响[D];南京农业大学;2010年
5 尹巧芝;资冲颗粒对卵巢颗粒细胞产生雌激素影响的研究[D];成都中医药大学;2003年
6 郝红娟;顺铂、VP-16、长春新碱、博来霉素对人卵巢颗粒细胞影响的比较研究[D];河北医科大学;2011年
7 秦丽娟;吗啡对体外培养的卵巢颗粒细胞LHR mRNA表达的影响[D];山西医科大学;2007年
8 杨涛;微囊藻毒素LR致大鼠卵巢颗粒细胞氧化损伤及机制探讨[D];福建医科大学;2011年
9 刘丽杰;雄烯二酮、促黄体激素和胰岛素对卵巢颗粒细胞分泌抗苗勒管氏激素水平的影响[D];浙江大学;2012年
10 欧阳江;正己烷对卵巢雌、孕激素合成干扰及其机制研究[D];福建医科大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 丁宏文;“返老还童”要当心[N];中国老年报;2001年
2 小蝶;腰粗未必是“发福”[N];中国人口报;2003年
3 林黎民;丙肝病毒体外培养获成功[N];中国医药报;2002年
4 辛综;体外培养卵细胞生存长达24小时[N];科技日报;2002年
5 ;我国科学家成功地在体外培养出神经干细胞[N];中国高新技术产业导报;2001年
6 姜瑞;我国肌腱体外培养再植研究取得重大进展[N];医药经济报;2006年
7 聂松义;脊髓损伤截瘫治疗现曙光[N];中国医药报;2001年
8 记者 阎新华;我科学家率先在体外培养成功胃肠器官[N];科技日报;2001年
9 记者胡德荣;心肌细胞能体外培养[N];健康报;2002年
10 周华、王立芳;世界首例成年体细胞克隆水牛诞生[N];人民日报海外版;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978