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拟南芥聚ADP-核酸葡聚糖水解酶基因PARG1在抗病和抗逆反应中的作用研究

李国钧  
【摘要】: 聚ADP-核酸化是一类在哺乳动物系统中起重要作用的转录后蛋白修饰方式。最近研究表明,聚ADP-核酸化也参与了植物的生长发育调节和逆境反应。本文利用T-DNA插入突变体和过量表达转基因株系研究了拟南芥聚ADP-核酸葡聚糖水解酶1[poly(ADP-ribose)glycohydrolase 1, PARG1]基因在灰霉病(Botrytis cinerea, B. cinerea)抗性和非生物逆境反应中的作用。 RT-PCR分析结果表明,B. cinerea侵染拟南芥,植株叶片中PARG1转录水平逐渐增强;光照诱导拟南芥植株叶片中PARG1转录水平增强;黑暗条件下,以水杨酸(salicylic acid, SA)喷雾处理拟南芥植株,SA诱导拟南芥植株PARG1转录水平增强,但在处理SA时遇光照,PARG1基因下调表达。茉莉酸(jasmonic acid, JA)、乙烯前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC)不诱导PARG1基因的表达。35S-GFP::PARG1结果显示,PARG1定位于细胞核和细胞质中。构建了PPARG1::GUS转基因株系,染色结果显示,PARG1在拟南芥植株的根尖、叶、花药内表达。 为了研究PARG1在抗病反应中的功能,筛选获得一个基于Ws-0生态型背景的T-DNA插入突变体parg1-3和一个基于Col-0生态型背景的T-DNA插入突变体parg1-4;构建了由CaMV 35S启动子驱动的基于parg1-3突变体背景的转PARG1基因过量表达系,PARG1-OE1/parg1-3和PARG1-OE2/parg1-3,与基于野生型Col-0背景的转PARG1基因过量表达系PARG1-OE1/Col-0和PARG1-OE2/Col-0。接着比较分析了上述突变体和过量表达转基因株系接种B. cinerea和番茄细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Pst DC3000)的病害表型。 喷雾接种B. cinerea或注射接种Pst DC3000后,parg1突变体的病害发病水平轻于野生型的病害发病水平,野生型的病害发病水平则轻于PARG1-OE株系的病害发病水平。接种病原菌后做菌量测试,parg1突变体叶片中B. cinerea生长量和Pst DC3000菌量均低于野生型中相应病菌菌量,野生型叶片中B. cinerea生长量和Pst DC3000菌量均低于PARG1-OE株系叶片的相应病菌菌量。B. cinerea侵染后,各株系病程相关蛋白基因(Pathogenesis-related protein gene,PR.)基因表达水平均无显著差异,说明PARG1调控拟南芥对B.cinerea抗病性不是通过调控PRs基因表达实现的。 考虑到活性氧和细胞死亡在B.cinerea侵染植物过程中的作用,以B.cinerea接种拟南芥,分析野生型、pargl和PARG1-OE株系的活性氧产生和细胞死亡状况。发现pargl突变体叶片中积累的活性氧含量比野生型叶片积累的活性氧含量少,而野生型叶片中活性氧的积累比PARG1-OE株系叶片中积累得少;同时发现在B.cinerea发病过程中,parg1植株叶片细胞的死亡数量比野生型叶片细胞的死亡数量少。为了进一步研究PARG1基因在细胞死亡中的功能,分别对拟南芥各株系接种Pst DC3000(avrRPM1)和高浓度Pst DC3000,PARG1-OE株系叶片细胞均比野生型叶片细胞易于死亡,而野生型叶片细胞均比parg1突变体叶片细胞易于死亡,说明PARG1参与过敏性细胞死亡的调控。考虑到聚ADP-核酸[poly(ADP-ribose),PAR]作为死亡信号的作用,应用PAR处理野生型、parg1突变体和PARG1-OE株系,发现PAR能诱导parg1突变体细胞凋亡,但并不引发细胞坏死,而caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO能部分抑制PAR引发的细胞凋亡,表明受PARG1调控的胞内PAR能诱导细胞凋亡,其凋亡途径部分依赖caspase凋亡途径。 本文还比较分析了parg1-3突变体和转基因过量表达株系对干旱等非生物逆境的表型差异。基因表达结果表明,干旱和氧化胁迫处理,野生型拟南芥中的PARG1基因上调表达。在含甘露醇和甲基紫腈(methyl Viologen,MV)的培养基中进行种子萌发实验,模拟干旱和氧化胁迫逆境,发现parg1-3种子的发芽率比野生型种子发芽率降低,但以脱落酸(absisic acid,ABA)处理进行萌发实验,两者种子表现出相似的发芽率。在干旱、渗透和氧化胁迫下,parg1-3植株比野生型植株表现出较弱的忍耐力。在干旱逆境下,野生型植株叶片的气孔完全闭合,而parg1-3植株叶片的气孔不能完全闭合;但在ABA处理下,parg1-3植株叶片与野生型植株叶片的气孔闭合状况相似。此外,在干旱逆境中,parg1-3植株与野生型植株的干旱逆境/ABA反应基因表达水平相似。而在氧化胁迫下,parg1-3植株中的氧化胁迫相关基因,如交替氧化酶1(alternative oxidase 1,Aox1)和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase 2,Apx2)下调表达。不论是干旱、渗透、氧化胁迫处理,还是ABA处理,PARG1的转基因过量表达株系均未表现出与野生型植株的差异。这些结果表明,PARG1基因在拟南芥对多种类型的逆境反应中起重要作用。 上述结果表明,PARG1基因可能通过调节细胞内的PAR含量,维持细胞内NAD+和ATP含量,在植物抗病和抗逆反应中起重要作用。研究结果对全面认识和理解拟南芥在抗病、逆境反应中的分子机制以及高等植物中聚ADP-核酸化的作用有积极的意义。


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